1740例慢性乙型肝炎患者替诺福韦酯耐药可能相关突变分析
梁兆玲刘 妍苏何玲 孟玉华 罗莉蓉 王静戴久增姚增涛徐东平
解放军传染病研究所 北京 100039
1.1研究对象2007年7月一2008年3月在解放军第三。二医院就诊和治疗的患者1 740例,男1 47 l例,女269例,年龄(37.2±13.6)岁,诊断符合我国2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》I慢性病毒性肝炎诊断标准,绝大多数患者接受过核苷(酸)类似物抗HBV治疗,但均未应用过替诺福韦酯(TDF)。收集患者血清用于检测。
1.2 HBV RT基因扩增 病毒DNA提取采用天泽基因工程有限公司生产的病毒DNAout试剂,HBVRT基因扩增采用我们建立的巢式PCR方法
1.3序列分析PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和同收纯化后,用ABl3730xl基凶分析仪进行双向DNA序列测定。用Vector NTI软件对序列测定结果进行分析,检测了与抗HBV核苷(酸)类似物耐药相关的RT区12个位点序列(173、180、181、184、194、202、204、214、215、217、233、250),对各个位点的序列峰图依次进行分析,与参考序列比对,分析是否存在插入或缺失突变,重点分析了与替诺福韦酯(TDF)耐药可能相关的A194T、V214A、Q215s以及A181V+N236嘴突变。当同—位点同时检出突变与未突变(野生)序列、且每种序列均达到总峰值的25%(即每种序列所占比例(≥20%)时,报告为突变,未突变序列共存,仍计入突变。
2结果
2.1与LAM等四种核苷(酸)类似物耐药相关突变检测分析在1 740例受检的CHB患者中,540例(31.0%)检出各种形式的核苷(酸)类似物耐药相关突变,其中LAM耐药相关突变345例,占63.9%,主要突变形式依次为(V173L)+L180M+M204Ⅳ(120例)、M204I(92例)、(V173L)+L180M+M204I(79例)、(V173L)+L180M+M204V/I(3l例)。ADV耐药相关突变96例,占17.2%,主要突变形式依次为A181V或A181T或A181T/V+N236T(20例)、V214A(18例)、N236T(17例)、A18IV(13例)。En耐药相关突变20例,占3.7%,主要突变形式为T184L或其他氨基酸(14例),同时伴有LAM耐药相关突变。LdT耐药相关突变14例,占2.6%,主要突变形式为(L180M)+M204I(9例)。ADV+LAM联合耐药突变54例,占10.o%;ADV+ETV耐药相关突变11例,占2.0%。
2.2与替诺福韦酯耐药可能相关的突变分析 未检mA194T突变;V214A单点突变检出34例(2.o%),其中单独fn现3l例,与180M+M204V同时…现l例,与L180M+M2041同时m现2例;Q215s单点突变检出3例(0.2%),其中l例与Q215P突变共存。此外,9例患者在Q215位点检出其他突变,包括Q215H 7例、Q215P和Q215E各1例。突变基因的代表』生测序峰图见图l。检m A181V+N236T突变12例,A181WT+N236T突变3例,均为ADV耐药患者。
3讨论
核苷(酸)类似物由于具有起效迅速、服用方便、不良反应小等优点容易被患者接受,作为抗HBV治疗的主要药物在临床上得到广泛使用。日前使用的四种药物LAM、ADV、ETV和LdT作用的靶位均为HBV的RT基因。早期使用的核苷(酸)类似物具有较高的突变耐药率,其中第一个上市的LAM 5年耐药突变发生率为70%,第二个上市的ADV 5年耐药突变发生率为29%f161。虽然近年上市的ETV和IAT对核苷类似物初治患者的耐药突变发生率不高,但对已有LAM耐药突变基础的患者由于基因屏障明显降低,突变发生率显著增高,其中ETV的3年耐药突变发生率为17%~32%,LdT的1年耐药突变发生率为7%~8%tt6l。临床上对二种或二种以上核苷(酸)类似物产生交叉耐药的CHB患者愈来愈多见,这些患者的抗病毒治疗较为困难,目前常联合使用一种核苷类似物(LAM、ETV或LdT)和一种核苷酸类似物(如ADV)控制耐药病毒复制,但由于ADV安全剂量较低,且在A181位点上的耐药突变与LAM耐药交叉,影响了其临床疗效。
我们对1 740例CHB患者血清HBV RT基因进行了序歹Ⅱ测定,根据上述文献资料,重点对CHB患者可能与TDF耐药相关的A194T以及可显著降低TDF药敏的V214A、Q215s和A181V+N234T进行了分析。共540例患者检出与核苷(酸)类似物耐药相关的突变,但未检测到A194T突变。检出了34例V214A突变、2例Q215S突变和15例A181V(或A18lV,I.)+N236T突变,如前所述,与TDF的耐药相关性还有待进一步明确。A181V+N236T是公认的ADV耐药突变株,对ADV的抗性强于其他形式的ADV突变株;V214A和Q215S两种突变株与ADV耐药相关性则存有争议闭,我们虽然从一些ADV耐药患者中检出了V214A突变,但也从多例未曾接受过ADV治疗的患者中检出了该突变,推测该突变对ADV耐药的影响相对有限。除3例Q215S突变外,我们还检出了9例其他形式的Q215突变,但这些突变与TDF耐药的相关性还未见报道。确定一种突变是否与耐药相关,应具备以下特征:①与使用治疗药物有关;②临床上出现病毒反弹和/或病情反复;③体外实验能证明变异病毒对治疗药物的敏感性降低;④可能出现在多个病例;⑤停药后病毒有可能恢复为野生型12-I。为此,对这些突变的临床意义还有待进一步确证。总之,我们通过对大样本CHB患者血清HBV RT基因的测序分析表明,未检出与TDF临床耐药可能相关的A194T突变,提示自然发生或应用LAM、ADV、ETv和uT后,由病毒基因突变引起TDF原发耐药的可能陛很小,预测该药在我国对治疗目前四种抗HBV核苷(酸)类似物耐药的患者应具有较好疗效;同时提示应当关注V214A和A181V+N236T突变可能对TDF临床疗效产生的负面影响。
本文节选自:《传染病信息》 2009年第22卷第4期 梁兆玲刘 妍苏何玲 孟玉华 罗莉蓉 王静戴久增姚增涛徐东平 解放军传染病研究所 北京 100039 《1740例慢性乙型肝炎患者替诺福韦酯耐药可能相关突变分析》