多糖几乎存在于所有生物体中,具有能量储存、防御功能、抗肿瘤作用、免疫促进活性等多方面的生物功能,所以近年来多糖成为天然药物研究的热点。槟榔十三味为丸剂(水丸),由槟榔、肉豆蔻、沉香、当归、木香、草乌(制)、筚拨、紫硇砂、葶苈子、丁香、广枣、干姜、胡椒等组成,调节“赫依”,安神止痛,用于心悸,失眠,精神失常,游走刺痛等症。本实验在研究广枣多糖组分的基础上,研究了槟榔十三味丸水溶性多糖组成和含量。关于槟榔十三味丸化学组分的研究尚未见报道。
1 仪器及药品
HP5890气相色谱仪,721型分光光度计(上海)。槟榔十三味丸由内蒙古蒙药制药厂提供,批号为990102。木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖为上海试剂二厂产品,核糖、阿洛糖、肌醇为进口试剂,其他试剂均为分析纯,双蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 多糖的提取及含量测定
2.1.1 水溶性多糖的提取和样品的制备:称取粉碎的槟榔十三味丸10.0 g,用三氯甲烷、丙酮抽提除去色素以及有机试剂溶解物,将药渣风干放入500 mL蒸馏瓶中,加双蒸馏水300 mL搅拌加热,温度控制在70℃~80℃,提取2 h,共提取3次,合并提取液,减压浓缩至15 mL,加乙醇沉淀,静置24 h,抽滤,分别用无水乙醇10 mL洗3次,再用丙酮10 mL洗3次,乙醚10 mL洗1次,干燥得白色槟榔十三味丸粗多糖1.35 g。经sp-sephadex C-25阳离子交换树脂提纯得1.15 g多糖。精密称取恒重槟榔十三味丸多糖0.012 1g,置于100 mL容量瓶中,加入0.5 mol/L H2SO420 mL,加热水解2 h,冷却至室温,稀释至刻度,待测水溶性多糖含量用。
2.1.2 糖含量的测定:精密称取葡萄糖对照品100mg,用纯水制成0.1 mg/mL的对照品溶液,分别稀释至10.00,20.00,30.00,40.00,50.00ug/mL 的5个不同浓度的对照品系列溶液,精密吸取1.0 mL置10 mL容量瓶中,加入5 苯酚1.5 mL混匀,加入浓硫酸7.5 mL,加水至刻度,旋涡混合5 min,再放置20 min后,在497 nm 波长处测定A值,求得标准曲线的回归方程为C=0.186 2A-0.002 774,r=0.999 7。在5~75 Pg葡萄糖质量与吸光度线性关系良好。取待测糖样品溶液0.2 mL按标准曲线的绘制方法测定A值,由回归方程计算槟榔十三味丸糖含量为88.4%,其产率为10.16%。
2.1.3 回收率试验:精密称取样品5 mg置于50mL容量瓶中,加入1 mol/L H2SO410 mL。加热水解2 h,冷却至室温,加入一定量葡萄糖对照品溶液,稀释至刻度,按2.1.2项下方法进行含量测定,结果平均回收率为100.9% ,RSD=0.91% (n=5)。
2.2 水溶性多糖的组分分析
2.2.1 各种单糖的GC分析:精密称取木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、岩藻糖各2 mg配成1 mg/mL的混合糖液。另分别配制阿洛糖、肌醇的1 mg/mL溶液。量取混合糖液0.2 mL依次加入28%浓氨水0.05 mL、肌醇0.05 mL和阿洛糖0.05 mL混合,量取0.2 mL,依次加入少量乙醇、氨水、四氢硼钠混合,在40℃水浴加热1 h,再依次加入冰醋酸10滴、1-甲基咪唑0.5 mL和乙酸酐5.0 mL,放置10 min,冰浴10 min,将溶液用KOH调至强碱性,再冰浴30 min,待分层后取出油层,用氮气吹干,然后用乙酸乙酯溶解,直接进行气相色谱分析。
气相色谱条件:色谱柱为HPX70毛细管柱,检测器和进样口温度均为270℃ ,柱温为180℃~230℃,9 min的程序升温,采用峰面积内标法定量(用肌醇和阿洛糖作内标)。单糖的气相色谱图见图1。(略)
2.2.2 水溶性多糖的组分分析:精密称取多糖约10.0 mg,加入2 mol/L H2SO4 10 mL水解2 h。取该溶液0.2 mL,按上述色谱条件测定,气相色谱图见图1。将水溶性多糖的单糖组成及其含量列入表1。水溶性多糖中单糖阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖的物质的量比为1.87:0.20:6.10:4.44 :22.22。
3 讨论
3.1槟榔十三味丸水溶性多糖含量为10.16%,其水溶性多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等组成,葡萄糖含量较高,有一定的阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖,少量木糖。
3.2 将单糖转化成多羟基醇时,用四氢硼钠还原,在实际操作中可使四氢硼钠微过量,再用冰乙酸分解过量的四氢硼钠,否则会干扰酰化过程。
3.3 为了便于GC分析,将多元醇酰化,制成易挥发、对热稳定的衍生物。这个过程是多元醇与乙酸酐的反应,该反应的好坏取决于反应条件,最重要的条件之一是催化剂的使用,本实验使用1-甲基咪唑。
3.4 实验用苯酚现用现配,标准曲线用苯酚的浓度与测定样品时用苯酚的浓度必须一致,否则糖含量测不准确。