消癌平(XAP)注射液是由通关藤根部提取的灭菌水溶液,为国内新一代纯中药抗癌药物,高效低毒,它具有独特的药理作用机制,既能够增强机体的免疫能力。又能够杀灭多种
肿瘤细胞,具有显著的抑制肿瘤之功效,并能明显延长
癌症患者的生存期。同时还具有消炎、平喘、利尿等治疗作用。为此我们通过体外培养
肝癌细胞Hepal一6,研究了消癌平对肝癌的生长抑制作用,并对其抑制生长的机制进行了探讨研究。
主要试剂与仪器:达氏修正依氏培养基(DMEM)为Inritrogen公司产品,小牛血清、胰蛋白酶(Trypsin)及噻唑蓝(MrITI’)均购自武汉博士德生物工程有限公司。青霉素、链霉素为HyClone公司产品。二甲基亚砜(DMSO):天津市化学试剂公司。鼠抗人Bcl一2、Bax、B—actin单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠多克隆抗体均购于Santa Cruz公司。ZS一2板式酶标仪(中国航天工业总公司),SW—CJ—FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),CO:细胞培养箱,光学显微镜。
细胞培养:小鼠Hepal一6肝癌细胞株由中国农科院细胞库提供,培养于含t0%胎牛血清、80 u,ml青霉素、100 U/ml链霉素的达氏修正依氏培养基(DMEM)培养液中,置37℃、5%CO:、饱和湿度条件下培养箱中培养,然后将细胞接种于培养瓶中贴壁生长,每3-4 d传代1次。
MTY法检测细胞增殖:取对数生长期Hepal一6肝癌细胞,用0.25%胰酶消化,以2x105/ml按每孔0.2 ml将对照组和不同浓度给药组细胞接种于96孑L培养板中,每个浓度设6个平行孔,同时设不加药的对照组和不含细胞的空白组.分别培养1、3、5 d后每孔加入MTF工作液(5 mg/m1)20 Ixl,继续孵育4 h,弃去孔内培养液,加入150 l DMSO,振荡使结晶溶解后,在酶标仪490 nm波长处检测各孔吸光度值(A,490
rim)。
细胞形态的观察及传代试验:将Hepal一6肝癌细胞接种于放有盖玻片的6孔培养板,待细胞贴壁后,加人不同浓度的消癌平,对照孔只加培养液,置于孵箱内3 d后取出覆盖有细胞的盖玻片,常规苏木素一伊红(HE)染色后观察。
结 果:消癌平对Hepal一6细胞增殖的影响:Hepal一6细胞在消癌平不同浓度、不同时间作用后,MTT比色法结果表明,消癌平抑制Hepal一6细胞的增殖,且对其生长抑制作用随消癌平作用时间的延长和剂量的增大而增加,呈时间和剂量依赖性。各给药组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),组问比较差异有统计学意义(P<0.O1)。
传代试验表明,对照组细胞正常贴壁生长、传代,分裂增殖旺盛,而给药的Hepal一6细胞则失去传代能力,出现悬浮现象。消癌平药物浓度越高,上述表现越明显,存在剂量依赖性。消癌平对Hepal一6细胞凋亡的影响:Hepal一6肝癌细胞经不同剂量组消癌平作用3 d后,均在GgG 期前出现一个亚二倍体峰,经凋亡程序软件去除细胞碎屑后分析,确认为凋亡峰,且该峰随着消癌平作用浓度的增高而升高。经10、20、30 mg/ml消癌平作用3 d后,凋亡细胞分别占(20.4+0.9)%、(34-4±0.9)%和(37.5±0.9)%。
本研究将其作用于小鼠Hepal一6肝癌细胞,通过MrIT试验发现,消癌平能够有效抑制Hepal一6细胞增殖,且呈明显的时间依赖性和浓度依赖性。肿瘤细胞常表现为分化不良或未分化,应用抗癌药物诱导肿瘤细胞分化,使其形态和功能趋向正常或接近正常,失去无限制生长繁殖的特征,从而达到抑制肿瘤的生长。为此我们通过细胞爬片HE染色,从形态学和细胞学加以验证,发现给药后Hepal一6肝癌细胞伪足回缩,细胞变小、变圆,核分裂像减少,凋亡细胞散在分布,细胞出现悬浮现象,失去传代能力,肿瘤的发生发展不仅仅是肿瘤细胞无限增殖的结果,同时也与肿瘤细胞的凋亡密切相关,二者在恶性肿瘤发生发展过程中的地位同等重要。细胞凋亡是由基因调控的细胞程序性死亡,其中存在Fas/Fas—L介导的死亡受体通路 和Bcl一2家族调节的线粒体通路 。
(本文节选自《消癌平抗肝癌细胞体外生长的实验研究》)