托莫西汀(atomoxetine,商品名:
择思达)是第1个用于治疗注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)的非兴奋性药物,目前已经在美国、英国、中国等多个国家上市并应用[1]。托莫西汀是一种去甲肾上腺素再摄取抑制剂,能选择性抑制突触前胺泵对去甲肾上腺素的再摄取,增强去甲肾上腺素的翻转效应,从而改善
多动症的症状,间接促进认知的完成和注意力的集中[2,3]。有关托莫西汀的药动学研究,国内未见中国人体内托莫西汀药动学研究的文献报道。本试验对口服
盐酸托莫西汀胶囊后在人体内的药动学过程进行研究。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent),包括G1379B自动脱气机,G1310A自动调配四元泵,G1329A自动进样器,G1316A可调柱温箱;Agilent 6410 triple quad LC/MS(美国Agilent);XW80A型旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂);BP110S型电子分析天平(德国Sartorius);MIKRO1224型高速离心机(德国Hettich);111型真空干燥箱(德国MMMGROUP)。
1.2 试药 盐酸托莫西汀胶囊(每片含托莫西汀10 mg,批号:20080901,有效期至2010年8月,由海南某制药厂提供);盐酸托莫西汀对照品(美国Sigma公司,批号:1004-0801002);内标物为盐酸氟西汀(浙江埃森医药有限公司,批号:A0907)。甲醇(默克公司,色谱纯);甲酸铵(美国Sigma公司,质谱纯);甲酸(迪马公司,色谱级);碳酸氢钠(广州化学试剂厂,分析纯);水为重蒸去离子水。
2 方法与结果
2.1 对照品和内标溶液 分别精确称取盐酸托莫西汀、盐酸氟西汀对照品11.7 mg和11.4 mg(分别含托莫西汀、氟西汀各10 mg),分别置10 mL容量瓶中,用流动相溶解定容至刻度,即配制成质量浓度为1 g•L-1的贮备液,贮存于4 ℃冰箱避光保存备用。试验前按试验所需稀释成相应浓度的标准工作液。另稀释配置质量浓度为3 000 μg•L-1的内标氟西汀流动相溶液。
2.2 受试者选择
试验前,试验方案和知情同意书经本院伦理委员会审批同意后,受试者签署知情同意书,并均进行常规体检和实验室检查(尿常规、血常规、肝功能、肾功能、心电图和胸透等),合格者入选为受试者。有15名志愿者签署知情同意书,经全面体格检查后,胸透、心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常者12名入组,男女各半,年龄为19~27岁,平均(25±4)岁,身高160~178 cm,平均(168±6)cm,体质量50~62 kg,平均(56±6)kg。试验后,受试者体格复查。受试期间1个月内未服用任何其他药物,且在1个月内禁烟和禁酒。
2.3 给药方案
12名受试者禁食12 h后,于试验日早晨7:30空腹开始试验。受试者一次性口服受试制剂20 mg,用200 mL温开水送服,服药4 h后给予统一低脂标准餐。给药后观察受试者的反应,记录受试者主诉的不良反应。
2.4 血样采集
每例受试者均于用药前在前臂静脉安置留置针抽血,用药前采空白血4 mL,再分别于安置留置针给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h分别采血3 mL/次,置肝素抗凝的试管中,3 000 r/min离心5 min,取血浆,分两份于-30 ℃下冰柜保存,待用。
整个试验过程均在医师和护士监护下进行,并于给药后不同时间监测受试者的反应,及时处理和记录试验过程中发生的不良反应。试验期间禁用其他药物及含咖啡因类饮料、烟和酒。
2.5 样品测定
2.5.1 色谱条件 色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×2.1 mm,5 μm);流动相:乙腈(含0.2%甲酸)水(含0.02 mol•L-1甲酸铵)(体积比80∶20);流速:0.3 mL•min-1;柱温:40 ℃。质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正离子化,扫描方式为选择性离子监测,托莫西汀m/z 256.1→44.1,氟西汀m/z 310.1→44.2,毛细管电压4 000 V,喷雾气压力206.85 kPa,气体流速8 L•min-1,气体温度350 ℃,碰撞能量8单位,裂解电压135 V,四级杆捕捉时间0.2 s,电子倍增器300 V。进样量为5 μL。
2.5.2 样品处理 取含药血浆0.5 mL置10 mL的带塞磨口锥形玻璃离心管中,加入3 000 μg•L-1的氟西汀甲醇溶液50 μL,快速振荡3 s,加饱和碳酸氢钠水溶液0.2 mL,快速振荡15 s,再加醋酸乙酯二氯甲烷(体积比4∶1)3 mL,密塞,旋涡振荡1 min,3 000 r•min-1离心10 min,吸取有机层置3 mL的带塞磨口锥形玻璃离心管内,42 ℃真空至干。进样前以200 μL流动相复溶,3 500 r•min-1离心10 min,吸取上清液5 μL进样。
2.5.3 方法专属性 分别取6名受试者的空白血浆0.5 mL 置10 mL的带塞锥形玻璃离心管中,除不加内标外,按“2.5.2”项依法操作,进样5 μL,获得空白血浆样品的色谱图,如图1(A);将一定浓度的对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中,依同法操作获得相应的色谱图1(B),托莫西汀、氟西汀的出峰时间分别约为1.24 min和1.26 min;取健康受试者给药后收集的血浆样品,依同法操作,得色谱图1(C)。结果表明,空白血浆中内源性物质不干扰托莫西汀及内标氟西汀的测定。
2.5.4 标准曲线的制备和最低定量限的确证 取空白血浆0.5 mL,分别加入质量浓度为10、20、50、100、500、1 000、5 000、10 000和15 000 μg•L-1的托莫西汀对照品溶液50 μL,振荡3 s,使血浆药物质量浓度分别相当于1、2、5、10、50、100、500、1 000和1 500 μg•L-1,其余按“2.5.2”项处理。经HPLC/MS/MS分析,以托莫西汀峰面积与内标峰面积之比(y)为纵坐标,以血浆托莫西汀浓度与内标浓度之比(x)为横坐标,权重系数为1/x2,得回归方程为y=0.5821x-2.5814×10-4,r=0.997 5(n=9),表明血浆中托莫西汀质量浓度在1~1 500 μg•L-1范围呈良好的线性关系。血浆样品托莫西汀定量下限质量浓度为1 μg•L-1(S/N>14),平行对5个质量浓度为1 μg•L-1的含药血浆样品处理后进行色谱分析,其方法回收率为101.82%,RSD为4.96%。
2.5.5 回收率及精密度试验 按“2.5.4”项方法分别配制低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)和高浓度(1 000 g•L-1)的托莫西汀血浆溶液各15份,分为3批,每批5份,并与每批的标准曲线同时进行,依“2.5.2”项方法处理后取5 μL进样,测定精密度,并计算质控样品的测得浓度,与配制浓度对照,求得方法回收率(见表1)。同法以空白血浆,除不加标准系列溶液和内标外,按“2.5.2”项方法处理后,再加入相应浓度的托莫西汀和氟西汀,取5 μL上清液进样,以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)、高浓度托莫西汀(1 000 μg•L-1)的提取回收率分别为84.78%、85.49%和86.04%。精密度和提取回收率见表1。表1 回收率与日内、日间精密度
2.5.6 稳定性试验 按“2.5.4”项方法分别配制低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)、高浓度(1 000 μg•L-1)的质控血浆样品,每个浓度21份样品分析,分为3组。分别考察了样品经室温放置1 h和24 h,冻融1次和3次,-20 ℃冻存1、12、24 d的稳定性。中、高2个浓度样品3种条件检测结果的RSD均<15%,低浓度样品3种条件检测结果的RSD均<20%。
2.5.7 质控样品的监控 按“2.5.4”项方法分别配制低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)、高浓度(1 000 μg•L-1)的托莫西汀血浆样品置-20 ℃冻存备用,此即为血浆质控样品。检测每批血浆样品前需做随行标准曲线,并随行检测质控样品低、中、高3个浓度,每个浓度至少两样本,并应均匀分布在未知样品测试顺序中;结果质控样品检测结果其相对标准偏差均在15%内(低浓度在20%)。
2.6 血浆样品中药物质量浓度的测定及药动学参数的计算
将12名健康志愿者单剂量给药20 mg受试制剂和参比制剂后的血药浓度列表并计算均值和标准差,绘制平均血药质量浓度时间曲线(见图2);用DAS程序对数据进行拟合,以实测值计Cmax、Tmax;以末端相血药浓度的对数值对时间进行回归,求得斜率K,再求算T1/2;运用梯形法求算AUC0-24和AUC0-∞,主要药动学参数见表2。将血药质量浓度时间数据用PKS程序处理,结果平均血药质量浓度时间曲线符合以权重为1/C拟合的口服给药二室模型。
2.7 不良反应情况
12名受试者在试验过程中,均未出现不良反应,试验后进行体格复查,胸透、心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常。表2 12名健康志愿者给药后的主要药动学参数
3 讨论
人血浆中托莫西汀浓度检测方法国内外未见文献报道。本文曾采用醋酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、正己烷以及醋酸乙酯二氯甲烷(体积比4∶1)作为提取液,通过比较发现醋酸乙酯二氯甲烷(体积比4∶1)混合提取液提取率最高,杂质也较少,故采用此混合提取液。本文建立的串联质谱检测方法,定量检测限达到1 μg•L-1,满足人体药动学研究要求。
盐酸托莫西汀胶囊人体药动学研究未见国内文献报道。单次口服20 mg后T1/2约为4.55 h,Cmax约为225.18 μg•L-1,Tmax为1.33 h,个体差异大,可能与CYP2D6存在个体差异有关,与文献[1-3]报道相似,用药时应引起医生注意。