血管性痴呆(VD)是由各种原因引起的慢性脑灌注不足所致的认知功能障碍, 海马CA1区是缺血缺氧最敏感的部位,N甲基D天(门)冬氨酸受体(NMDAR)1(NR1)是NMDAR的功能亚基,代表NMDA分布。盐酸
多奈哌齐片是近年来用于治疗VD的胆碱酯酶抑制剂。本研究通过建立拟VD模型,采用对照研究的方法观察实验动物海马CA1区神经细胞形态学变化、NR1表达和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)、过氧化氢酶(CAT)的活力,探讨盐酸多奈哌齐片神经保护机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及分组 雄性SD大鼠48只(购自郑州大学实验动物中心),质量(400±50)g,随机分为假手术组、VD对照组和多奈哌齐组,每组16只。
1.1.2 主要仪器及试剂 MG2 Y型迷宫(张家港市生物医学仪器厂);NR1免疫组化试剂盒(博士德生物工程有限公司);GSHPX、CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所);盐酸多奈哌齐片(法国PFIZER PGM公司制造,卫材中国药业有限公司分装)。
1.2 方法
1.2.1 模型制备及药物干预 将大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰卧固定在手术台上,常规消毒,颈正中切口,分离双侧颈总动脉(CCA)。VD对照组和多奈哌齐组腹腔注射硝普钠(2.5 mg/kg,用无菌蒸馏水溶解),随即将CCA夹闭、再通、再夹闭各10 min后再通,缝合伤口,放回笼中保温饲养。假手术组不阻断CCA,不注射硝普钠,余操作过程相同。造模过程中保持动物肛温在37℃左右,以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。多奈哌齐组于大鼠完全清醒4 h后,给予多奈哌齐1 mg/kg(溶解于生理盐水中)灌胃,每日1次共30 d;假手术组和VD对照组给予生理盐水1 ml共30 d。
1.2.2 Y型迷宫试验 术后第25 d行迷宫测试,先将大鼠放入迷宫中适应3~5 min,然后以无规则次序变换安全区,以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。大鼠受电击逃到安全区后以大鼠所在支臂作为下一次测试的起始位置,每个实验日在固定时间(下午5~8点)对每只大鼠进行20次训练,连续5 d。以大鼠在足底通电后10 s内一次性跑向安全区为正确反应,否则为错误反应;全天完成所有反应所需时间称为全天总反应时间 (TRT)。每日出现错误反应次数(EN)≤2次、TRT≤120 s作为判定大鼠学习记忆的标准。
1.2.3 NR1表达水平检测 术后第30 d行为学测试完毕后每组随机选取8只大鼠麻醉后经心脏灌注内固定取脑,在鼠脑最宽部位(海马冠状位)取厚度为3 mm的脑片,置4%多聚甲醛溶液中固定24 h,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋,连续冠状切片,片厚约5 μm,每只大鼠取5张切片,分别进行HE染色及SP免疫组化染色检测NR1表达水平,实验步骤严格按说明书进行。采用Qwin 550 CW图像处理与分析系统,每张切片同一区域中,随机选取8个视野,检测面积大致相同,采集8组数据,取均值作为该切片NR1的平均灰度值。
1.2.4 GSHPX、CAT活力测定 各组另外8只大鼠麻醉后断头,冰盘上取脑,小心剥离海马,按标本质量用生理盐水配成10%的脑匀浆,低温、3500 r/min、离心10 min,取上清液,按GSHPX、CAT试剂盒说明操作测出光密度(OD)值,用考马斯亮蓝检测标本蛋白质含量,并计算出酶活力。OD值越高,酶的活力越低。
1.2.5 统计学方法 数据以均值±标准差(±s)表示,使用SPSS10.0统计软件,两样本均数间采用t检验,组间均数的显著性检验用单因素方差分析,满足正态分布及方差齐性要求时采用LSD法,不满足方差齐性要求时, 则采用DunnettC法。
2 结果
2.1 各组大鼠学习记忆成绩的比较 见表1。与对照组相比,假手术组和多奈哌齐组,EN明显减少,TRT明显缩短(均P<0.01),假手术组和多奈哌齐组间差异无统计学意义。
2.2 各组脑组织形态学改变的比较 见图1~3。HE染色可见假手术组大鼠海马CA1区神经细胞数目多,排列紧密、均匀而整齐,胞核呈圆形或椭圆形,核仁明显,染色质均匀;对照组神经细胞结构松散、数目减少、排列紊乱,胞核深染、固缩,核仁消失,胞浆周围发现空晕,胞间距较大,并可见大量不规则形胶质细胞及散在胶质细胞增生小结,仅见少量正常神经细胞;多奈哌齐组正常神经细胞数目较多,排列较密,胞核圆或椭圆形,核仁清晰,染色质丰富,少见固缩变性的神经元。
2.3 各组NR1分布及免疫灰度值的比较 见图4~6及表2。假手术组海马CA1区层次清、排列紧密,可见NR1阳性神经元胞膜呈黄色,胞浆较淡,胞体大圆或椭圆形;对照组层次减少,排列稀疏,残余的NR1阳性神经元胞膜呈深棕黄色,并可见胞核着色;多奈哌齐组神经元数目明显增多,层次清,排列较密,NR1阳性神经元明显减少且染色淡黄。NR1阳性神经元免疫反应灰度值假手术组与多奈哌齐组间差异无统计学意义,且显著低于对照组(均P<0.01)。
2.4 各组GSHPX、CAT活力的比较 见表2。对照组GSHPX、CAT的活力低于多奈哌齐组及假手术组(P<0.05~0.01);多奈哌齐与假手术组间差异无统计学意义。
3 讨论
VD的确切发病机制目前尚不清楚。以谷氨酸受体为代表的兴奋性氨基酸受体,特别是NMDAR在中枢神经系统与短时学习记忆的形成密切相关,并可以产生兴奋毒性作用导致神经元丢失。脑缺血后NMDAR活化是导致脑缺血后学习和记忆障碍的一种重要因素。有研究表明,缺血后NMDAR表达增加,并导致胞内钙超载触发系列生化改变,诱导相关基因的表达可能是导致海马细胞死亡的重要原因。
本实验结果发现,对照组神经细胞结构松散、数目及层次减少、排列稀疏,残余的NR1阳性神经元表达显著增高,表现为胞膜着色明显加重,呈深棕黄色,并可见胞核着色,GSHPX、CAT的活力却低于假手术组和多奈哌齐组;多奈哌齐组的神经元数目明显增多,层次清、排列较密,NR1阳性神经元明显减少且染色淡黄,只见到部分神经元着色, CAT、GSHPX活力较对照组有较明显地提高。表明盐酸多奈哌齐片对缺血缺氧的神经元有较显著的保护作用,其机制可能为:(1)拮抗NMDAR,主要是下调NR1的表达,来阻断由其引发的钙超载,进而阻断一系列导致的神经元损伤的级联反应;(2)提高抗氧化酶GSHPX和CAT的活性,对抗过氧化氢导致的神经元损伤。
Akasofu 等的研究发现,盐酸多奈哌齐片对处于缺血缺氧环境下的原代培养神经元预处理12 h后,可减少乳酸脱氢酶(LDH)引发的NMDA释放和海人酸的释放,进而降低钙的浓度,减少细胞内钙超载,从而减轻了由NMDA诱发的神经元损伤。有研究发现盐酸多奈哌齐片可改善缺血脑组织的代谢、对抗细胞凋亡而起到保护神经元的作用。
总之,NR1的表达增高和GSHPX、CAT活力的降低与VD发病有关,盐酸多奈哌齐片不仅可以通过促进脑部乙酰胆碱的功能来改善认知障碍,而且也可能通过降低NR1的表达,提高GSHPX、CAT的活性等多途径的分子生物学机制来减轻神经元损伤。