人们很早就发现,
肿瘤组织内及其周围存在着大量T/NK细胞。与机体其他部位相比,肿瘤及其周围组织中的T/NK细胞功能显著降低[1]。当今,常以T/NK细胞为效应细胞,以IL-2为刺激剂作为肿瘤的过继性免疫治疗的手段,但对大部分病人疗效不佳,其原因是肿瘤及其周围组织内也存在大量富含单核/巨噬细胞的单个核细胞 (Mo)。 Mo 对荷瘤动物淋巴细胞抗肿瘤作用有抑制效应,这种抑制作用与Mo分泌反应性氧代谢物(reactive oxygen metabolites,ROM)密切相关[2]。二氢氯化物组胺(简称组胺)可以逆转ROM对T/NK抗肿瘤活性抑制作用,并且已做II期临床试验,效果明显[1],但其毒副作用大,临床难于应用。为了寻求高效低毒、便于临床应用的ROM逆转剂,我们进行了
还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)在体外
白血病细胞株培养体系中逆转ROM、增强NK细胞杀伤K562细胞的实验研究,现将结果报道如下。
材料和方法
材料
K562细胞株由福建医科大学附属协和医院老年病研究所朱元贵博士惠赠,新鲜健康人单的采白细胞由泉州市中心血站提供,IL-2为北京双鹭药业公司产品,二氢氯化物组胺、GSH和MTT均为Sigma公司产品,CD3、CD56免疫组织化学试剂盒为北京中山公司产品,活性氧测试剂盒为南京建成公司产品。
方法
富含NK细胞的单个核细胞(E)的分离 采用Percoll不连续密度梯度分离法[2]分离,采用免疫组织化学法进行鉴定[3],其纯度达30%,活存率≥95%。
富含单核细胞的单个核细胞(Mo)的分离 采用Colotta方法[2]分离并作非特异性酯酶染色鉴定纯度,4℃冷藏备用,其纯度为70%,活存率≥95%。
细胞培养及检测
将富含NK细胞的单个核细胞(E)、K562细胞(T)按E/T比10∶1、10∶5、10∶10 3个比例加入相应的96孔培养板中(NK细胞为105/孔),肿瘤组织中淋巴细胞与单核细胞的比例在文献中未见报道,我们观察30份恶性肿瘤的病理切片及慢性髓细胞白血病的骨髓涂片,其比例多数在10∶1至10∶3,少数高达10∶10,因此,在E/T为10∶1的比例孔中按E/Mo细胞为10∶2、10∶5、10∶10比例添加单核细胞,以仅加K562细胞、NK细胞、Mo、NK细胞+Mo、Mo+K562细胞及不加任何细胞的全空白作为对照,混合培养6小时检测ROM产量,同时在24小时用MTT法[4]检测K562细胞抑制率(K562 cell inhibition rate,KIR),计算公式为KIR=(1-ODE/T-DDE/ODT)×100%。每组每种检测各作3个复孔,观察ROM产量与KIR、NK细胞数量、Mo数量之间的关系。
GSH作用的测定
以二氢氯化物组胺为阳性对照,以K562+NK+Mo+IL-2为空白对照,检测GSH逆转ROM及提高K562细胞抑制率的作用。按上述细胞比例先分别入NK细胞、单核细胞、IL-2(150 U/ml) (方法根据文献[5] ),同时在各个比例孔中分别加组胺(10、20和50 umol/L 3种浓度),GSH(25、50、100和250 μmol/L 4种浓度),在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下共培养24小时后加入K562细胞(按E/T比为10/1),再培养6小时及24小时,检测ROM产量,同时用MTT法检测K562细胞抑制率,KIR=(1-ODE/T-ODE/ODT)×100%;同样每组每种检测各做3个复孔[4]。
ROM检测
采用紫外分光光度比色法、按南京建成活性氧测试盒说明操作,检测活性氧的产量。
K562细胞抑制率 采用MTT法检测(公式见上)。
统计学分析
采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。计量资料结果以x±SD表示,多组均数比较采用广义线性模型(general linear model),各实验组均数间多重比较采用LSD-t检验(方差齐)或Dunnett T3检验(方差不齐时),双变量相关分析采用Pearson相关分析。以P<0.05 作为差异显著性检验水平。
结 果
GSH对ROM产量及NK细胞抑制K562的影响
当E/Mo=10/2时,各种浓度GSH和组胺均可明显降低ROM产量,提高K562细胞抑制率(P<0.05),逆转ROM作用GSH强于组胺;当E/Mo=10/5时,各浓度组胺和高浓度GSH可减少ROM产量(P<0.05),但不能提高K562细胞抑制率;当E/Mo=10/10,仅高浓度的组胺和高浓度GSH可减少ROM产量(P<0.05),各种浓度的组胺和GSH均不能提高K562细胞抑制率(P>0.05)(
NK细胞、Mo、IL-2对ROM产量和K562细胞抑制率的影响
结果显示:K562细胞加入NK细胞后,ROM产量减少(P<0.05),K562细胞抑制率达65.50%,而加入Mo后ROM产量明显增加,且Mo浓度越高,ROM产量越多,呈量效关系(P<0.05),但K562细胞不被抑制(P>0.05);加入激活剂IL-2后,K562细胞+NK细胞混合培养体系中ROM产量明显增多(P<0.05),K562细胞的抑制率明显提高(P<0.05);
在K562+NK+IL-2培养体系中加入Mo,ROM产量增多,且Mo浓度越高,ROM产量越多,E/Mo=10/1或E/Mo=10/5,K562细胞抑制率改变不明显,当E/Mo=10/10时,K562细胞抑制率从86.5%降至48.09%(P<0.01)(表2) 。Table 2. Effect of NK cells and/or monocytes on ROM yield and K562 cell inhibiton rate(略)
ROM产量与K562细胞抑制的关系
ROM的产量与K562细胞的抑制率呈负相关(r=-0.56,P<0.05),ROM产量越高、K562细胞的抑制率越低。随着Mo浓度的升高,ROM的产量增多,K562细胞的抑制率逐降低,且呈量效关系(P<0.05)。
近年来研究发现,肿瘤/白血病细胞内GSH/GST-S活性增高使肿瘤/白血病细胞产生多药耐药性[10,11],细胞内的GSH增多,降低了化疗效果。GSH是肿瘤/白血病多源耐药的机制之一,我们得出了与文献报道相反的结果的原因是:文献报道GSH影响肿瘤/白血病疗效指的是化疗疗效,因为许多化疗药物进入细胞内主要通过产生ROM而发挥作用,在ROM作用下线粒体还原型巯基转化为氧化型二硫键,使线粒体通透性转换孔(mtPTP)开放,并进一步诱导细胞凋亡[12]。因此,肿瘤/白血病细胞内GSH增多,化疗药效降低;而在过继性免疫治疗中,GSH在肿瘤/白血病细胞外起到逆转Mo产生的ROM,保护T/NK细胞免受ROM的损伤,充分发挥T/NK细胞的抗肿瘤作用。
综上所述,GSH具有逆转ROM,提高NK对肿瘤/白血病细胞的抑制活性,毒副作用轻微,可能成为继组胺之后更理想抗肿瘤/白血病免疫佐剂,值得进一步研究。