心肌细胞凋亡是近年国内外研究的热点,在许多心血管疾病如心肌梗塞、心脏猝死等的发生发展中,心肌细胞凋亡可能是重要的参与机制之一。近年研究认为ISO可诱导心肌细胞凋亡的发生,但其机制不明。肉蔻五味丸是具有民族特色的传统复方制剂,由广枣、木香、土木香、筚茇、肉豆蔻组成。本实验采用大剂量ISO诱导的大鼠心肌梗死为模型,通过与卡托普利的对照研究,观察肉蔻五味丸是否具有治疗心肌梗死的作用,并从分子水平探讨肉蔻五味丸治疗心肌梗死损伤的作用机制。
1 材料
1.1 动物:雄性SD 大鼠66 只,体重(200±20)g ,由杭州省动物中心提供。合格证号SCXK浙2003-0001。
1.2 药品:盐酸异丙基肾上腺素注射液(ISO):上海禾风制药有限公司生产,批号:H31021344;卡托普利:安徽芜湖市博英制药有限公司,批号:H34023645;蒙药肉蔻五味丸:内蒙古乌兰浩特市中蒙制药有限公司,批号:Z15021785。
1.3 试剂:细胞凋亡检测试剂盒,编号:MK1020,武汉博士德公司产品。CoCl2•6H2O 试剂,上海生工生物工程有限公司产品。
1.4 仪器:多导电生理记录仪ML785 SP9612POWERLAB/ 8SPADI(澳大利亚); 病理图象分析系统OLYMPUS CX40LOGENE- I PAS9000;DU640 紫外可见光分光光度计(美国贝克曼公司)。
2 方法
2.1 动物分组:将66 只雄性SD大鼠随机分为6 组,正常组6只,模型组12 只,卡托普利治疗组12只,肉蔻五味丸低剂量治疗组12只,肉蔻五味丸中剂量治疗组12只,肉蔻五味丸高剂量治疗组12 只。
2.2 模型制备及取材:模型组和治疗组大鼠皮下注射IS010mg/kg,连续3 天。并以注射IS0 第3 天后心电图的改变来判断模型成立。卡托普利组和肉蔻五味丸组在注射IS0 第3 次后12 小时开始分别给予卡托普利50mg/ kg ,低剂量肉蔻五味丸0.2g/ kg ,中剂量肉蔻五味丸0.5g/ kg ,高剂量肉蔻五味丸1g/ kg 灌胃,模型组与正常组则灌胃等体积的生理盐水,1天1次,至各实验终点。各组实验动物在开始灌胃后3d、7d相应时段用3 % 戊巴比妥钠50mg/ kg 腹腔麻醉后分别处死6只,正常对照组于第7 天全部处死。心脏取血做IMA,心脏标本用4 %甲醛固定24h,做4μm 厚的石蜡连续切片,分别做HE 和TUNEL 染色。
2.3 IMA 检测:根据Bar-Or等建立的比色测定法测定。将50μl 0.1 % CoCl2•6H2O 水溶液中加入200μl 待测血清,轻轻混匀,放置10min,再加入50μl15 %二巯基苏糖醇(DTT)水溶液,使其显色2min,最后加入0.9 % NaCl 溶液10ml 终止反应,用紫外可见分光光度计测定其在470nm 处的吸光度ABSU;同时,每一测试样本均要求做样本空白(加DTT 改为加蒸馏水),结果用吸光度单位报告(ABSU)。
2.4 原位细胞凋亡检测:采用TUNEL法,具体步骤按试剂盒说明操作,阳性判定标准:细胞核被染成棕褐色为阳性结果。
2.5 统计学方法:采用SPSS1310 软件分析,用均数±标准差(X ±S)表示,两组间比较用t 检验,多组间比较用单因素方差分析。
3 结果
3.1 心肌梗死大鼠心脏的病理变化
肉眼观:心肌梗死区形状不规则,梗死灶呈苍白色,第7 天在梗死灶周边出现明显的充血、出血带。光镜下可见心肌细胞浆嗜伊红性增高,心肌纤维不均匀性肥大,胞核增多,增大深染,梗死灶边缘可见充血带及中性粒细胞浸润,正常组大鼠未见异常改变。
3.2 IMA 检测
用比色法测定血清中白蛋白与外源性钴结合能力的变化,结果用吸光度单位报告(ABSU),见表1。
各组大鼠造模后IMA 情况提示:ISO 造成心肌缺血损伤可明显引起IMA 降低,尤以早期显著,肉蔻五味丸中、高剂量治疗组及卡托组可显著提高IMA 水平,与模型组比较差异有显著性( P< 0.01),与卡托普利治疗组比较,肉蔻五味丸高剂量治疗组无明显差异(P >0.05)。
3.3 心肌细胞凋亡检测结果TUNEL 法检测各组大鼠心肌细胞凋亡的情况以细胞核被染成棕褐色为阳性表达,阴性对照片(PBS为一抗)无棕黄色着色。每张切片在光镜下随机选取10 个视野,计算在1 000个细胞中的阳性细胞数。结果见表2。
各组大鼠造模后心肌细胞凋亡情况提示:连续注射异丙基肾上腺素造成大鼠心肌缺血损伤,可明显引起心肌细胞凋亡,尤以早期显著,肉蔻五味丸治疗组及卡托组心肌细胞凋亡阳性细胞数明显减少,与模型组比较,差异有显著性(P < 0.05),其中尤以肉蔻五味丸高剂量组更为显著。
4 讨论
大剂量异丙基肾上腺素(i soprenaline,ISO)所造成的大鼠心肌梗死模型,其心电图演变、心肌代谢改变及组织病理学的变化均与人类自然发生的急性心肌梗死非常接近;本实验中心电图显示异常Q 波,ST 段抬高超过0.05mv,与临床心肌梗死的心电变化相似,提示模型成功建立。
心肌梗死会导致白蛋白的N末端结构发生一些改变,正是这种结构的改变影响了白蛋白与外源性钴元素的结合能力。因此通过检测血浆中白蛋白与钴元素的结合能力,就可以了解因梗死而改变的白蛋白的水平。心肌缺血血清白蛋白与钴离子的结合和非梗死相比结合力下降,本实验结果显示治疗组与模型组相比( P< 0.05)有显著意义。
目前虽然对心肌梗死损伤的确切机制还不十分清楚,但已证实,持续性心肌缺血可以导致组织损伤和细胞死亡,过去认为心肌细胞在梗死损伤中死亡全部是坏死,但近年来大量的研究表明大鼠及人的心肌梗死损伤中有大量的心肌细胞经历了调亡过程〔2~5〕。本实验中给药组动物心肌梗死边缘区凋亡现象的观察显示药物治疗组的凋亡阳性细胞数较模型组明显减少,给药3 天与7 天时相比,随着给药时间的延长,凋亡有所减少,与模型组比较,卡托治疗组与肉蔻五味丸高剂量治疗组的细胞凋亡阳性数显著降低(P < 0.01)。本实验提示通过抑制和阻断细胞凋亡的发生,可能是蒙药肉蔻五味丸防治冠心病心肌梗死损伤的作用机制之一。