抗栓胶囊是安徽中医学院第一附属医院院内制剂,曾用名为通脑精胶囊,该方由大黄、川芎等4味中药组成,功能行气化痰、活血解毒,主要用于治疗老年性
中风[1]等疾病。前期研究过程中曾对其中大黄素的含量进行了薄层色谱法的含量测定[2]。为了建立该制剂的规范化定量分析方法,更好地控制本品质量,本课题组对该制剂进行了含量测定方面的提高研究。本试验采用高效液相色谱(HPLC)法对其君药大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚5种成分的含量同时进行测定。现报道如下。
1 仪器与试药
WATERS高效液相色谱仪(600泵,2487检测器,Millennium32工作站),BP211D电子天平(德国塞多利斯公司),HH-S型水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂),500 mL调温电热套(上海浦东新区电理仪器厂),SK3200H超声清洗器(上海科导仪器有限公司)。
抗栓胶囊含量测定用对照品均购自中国药品生物制品检定所,批号分别为:芦荟大黄素0795-200605,大黄酸0757-200005,大黄酚0796-2002081,大黄素0756-200110,大黄素甲醚0758-200610。甲醇为色谱纯;水为二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 ?m);柱温:25 ℃;检测波长:254 nm;流动相:甲醇-0.1%磷酸(85∶15);流速:1.0 mL/min;进样量20 /L。理论板数以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚计算均不低于10 000,5个成分与相邻峰之间分离度均大于1.5,对称因子在0.95~1.05之间。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取五氧化二磷减压干燥的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量,加甲醇分别制成1 mL含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚各约0.2 mg的溶液;分别精密量取上述对照品溶液2 mL置10 mL量瓶中,混匀,即得。
2.3 供试品溶液的制备
参照文献[3-4]随机取黄芎抗栓胶囊5粒,除去胶囊壳,内容物混匀,精密称取内容物约0.5 g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声(功率300 W,频率50 kHz),放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液5 mL,置烧瓶中,挥去溶剂,加8%盐酸溶液10 mL,超声处理2 min,再加三氯甲烷10 mL,加热回流1 h,放冷,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗涤容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷层,酸液用三氯甲烷提取3次,每次10 mL,合并三氯甲烷液,减压回收溶剂至干,残渣加甲醇使溶解,转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.4 专属性试验
按处方比例制成缺大黄阴性对照品,按“2.3”项下方法制备缺大黄阴性样品溶液。精密吸取上述对照品、供试品、阴性样品溶液各20/L,照“2.1”项下色谱条件测定。结果阴性样品溶液在各对照品保留时间位置上均未见干扰。
2.5 线性关系考察
精密量取含芦荟大黄素(0.230 mg/mL)、大黄酸(0.224 mg/mL)、大黄素(0.223mg/mL)、大黄酚(0.257 mg/mL)、大黄素甲醚(0.287 mg/mL)的混合对照品溶液0.5、1、2、4、8 mL,分别置10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇勺,0.45 ?m微孔滤膜滤过,按“2.1”项下的色谱条件测定,每次进样20 ?L。以进样浓度(?g/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归,计算其回归方程及线性范围。芦荟大黄素:Y=161 803X-131 692,r=0.999 8,线性范围0.230~3.68 ?g;大黄酸:Y=154 631X+52 006,r=0.999 9,线性范围0.224~3.584 ?g,大黄素:Y=152 878X-791 770,r=0.999 8,线性范围0.223~3.568 ?g;大黄酚:Y=163 597X-129 101,r=0.999 9,线性范围0.257~4.112 ?g;大黄素甲醚:Y=158 720X-132 792,r=0.999 8,线性范围0.287~4.592 ?g。
2.6 精密度试验
精密量取供试品溶液20 ?L,连续进样5次,测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.78%、0.91%、0.37%、0.46%、0.24%,表明精密度较好。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件测定,测得样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.78%、1.06%、1.86%、2.19%、2.37%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批样品,平行制备 6 份供试品溶液,按上述色谱条件测定峰面积并计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的含量,其RSD分别为2.11%、1.93%、1.58%、1.94%、2.41%。
2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品(含芦荟大黄素2.359 mg/g、大黄酸3.695 mg/g、大黄素3.137 mg/g、大黄酚4.257 mg/g和大黄素甲醚1.996 mg/g)6份,每份适量,分别精密加入一定量的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品,按“2.3”项下方法制成溶液,按上述色谱条件测定,计算回收率。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(n=6)
2.10 样品的测定
取3批抗栓胶囊,按“2.3”项下方法制备供试品,每批样品3份。精密吸取供试品溶液20 /L,按照上述色谱条件测定并计算含量,结果见表2。表2 黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分含量测定结果(mg/g,n=3)
3 讨论
抗栓胶囊由大黄、川芎等4味中药组成,大黄为方中君药,通过控制大黄中有效成分的含量可以很好地控制该制剂的质量。大黄中蒽醌类成分含量测定方法文献报道较多,色谱条件及制备方法也多种多样,但多采用单一成分含量的测定,不能全面控制制剂的质量。本课题组在以往的研究中曾用薄层色谱法测定了3批样品中大黄素的含量,本试验的目的旨在更进一步提高该制剂的质量控制水平。由于大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚5种蒽醌类成分的含量均较高,故选择以上5种蒽醌类成分作为含量测定的指标成分。笔者在本项目的研究工作中,参照2005年版《中华人民共和国药典》(一部)“大黄”项下制备方法[5],并采用其测定波长254 nm同时对5种蒽醌类成分进行定量测定,试验结果表明该方法可行,分离度较高,可作为抗栓胶囊的质量控制方法。