注射用
胸腺肽α1主要成分为胸腺肽α1,是化学合成的28肽,临床用于
慢性乙型肝炎和作为免疫损害病者的疫苗免疫应答增强剂。在2010年版中国药典二部中收录的注射用胸腺肽α1标准[1]和国家食品药品监督管理局颁布的药品试行标准(YBH26822005)中规定的含量测定方法,梯度洗脱时间较长,操作繁琐且重复性较差。本实验对注射用胸腺肽α1含量测定方法进行了改进,现报道如下。
1 试药与仪器
1.1 试药
胸腺肽α1对照品及注射用胸腺肽α1(海南某药品研发公司提供),对照品含量:99.78%,乙腈为色谱纯,磷酸二氢钾为分析纯。
1.2 仪器
Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);DAD二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Luna C18 ( 5μm ,4.6mm×250mm);以0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.7)乙腈(92∶8)为流动相A,乙腈为流动相B,采用梯度洗脱,在8min之内流动相B由3%增加到9%,在2min之内流动相B降为3%,并平衡5min,检测波长为210nm,进样量20μL,理论板数按胸腺肽α1峰计算应大于5000。
2.2 测定方法
余邦良等.HPLC法测定注射用胸腺肽α1的含量
取本品适量,用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)溶解,制成1mL中约含胸腺肽α1 0.1mg的溶液,作为供试品溶液(临用前配制),精密量取20μL,注入液相色谱仪,参照高效液相色谱法[2],记录色谱图;另精密称取胸腺肽α1对照品适量,用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)溶解,制成1mL中约含胸腺肽α1 0.1mg的溶液,作为对照品溶液(临用前配制),同法测定,按外标法以峰面积计算,其平均含量应符合规定。
2.3 辅料干扰试验
按处方量精密称取甘露醇、氢氧化钠,并另取注射用胸腺肽α1,按“2.2项”制成辅料溶液和供试品溶液,分别取20μL注入液相色谱仪,按含量测定法记录色谱图(图1、2),从图谱上可以看出, 这些辅料在主峰吸收处均无吸收,故不影响注射用胸腺肽α1含量的测定。
2.4 回收率试验
称取按处方量计算的辅料9份,分别加入标示量80%、100%、120%的胸腺肽α1,每种标示量各3份样,分别置相应的量瓶中,按“2.2项”制成供试品溶液,按含量测定方法,记录色谱图,计算其回收率。平均回收率为99.4%,RSD为0.25%。
2.5 精密度试验
取同一批号的注射用胸腺肽α1 6瓶,按“2.2项”制成供试品溶液,按含量测定方法,每个供试品溶液平行测定6次,记录色谱图,主峰面积的RSD为0.34%。
2.6 配液稳定性试验
取注射用胸腺肽α1适量,按“2.2项”制成供试品溶液,将其放置在20~25℃的室温下,分别于配样后第0、2、4、8、12h取样按含量测定方法分析,主峰面积的RSD为0.54%,结果表明供试品溶液在12h内较稳定。
2.7 线性试验
取注射用胸腺肽α1适量,按“2.2项”制成1mL中约含胸腺肽α1 1mg的溶液,并分别稀释成含胸腺肽α1 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/L 的溶液,按含量测定方法测定,记录色谱图,以进样浓度X(mg/L )为横坐标,胸腺肽α1峰面积积分值Y为纵坐标,绘制标准曲线。计算其线性方程为:Y=18980X+13480433,r=0.9999。线性范围0.05~0.8mg/L。
2.8 样品含量测定
取注射用胸腺肽α1 8瓶(1.6mg/瓶),各瓶精密加入0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)1.6mL溶解,合并,精密吸取5mL置50mL量瓶中,稀释至刻度,制成1mL中约含胸腺肽α1 0.1mg的溶液,作为供试品溶液(临用前配制),精密量取20μL,注入液相色谱仪,按高效液相色谱法[2],记录色谱图;另取经五氧化二磷干燥至恒重的胸腺肽α1对照品适量,同法测定,按外标法以峰面积计算其平均含量。3批样品含量分别为100.9%、100.1%、100.2%。
3 讨论
原法 “YBH26822005” 的含量测定的梯度洗脱,在20min内流动相B由0增加到9%,然后在1min内流动相B降为0,并用流动相A平衡10min。经试验发现该法耗时长,且重现性差。本文对其梯度洗脱法进行修改:在8min之内流动相B由3%增加到9%,在2min之内流动相B降为3%,并平衡5min。
通过方法学研究,发现各项试验均符合规定,且与原法的含量检测结果一致,同时克服原法检测时间长、重现性差的缺点。使用该法测定含量准确、快速、简便,专属性提高,有利于更好地控制产品质量,进一步完善产品的质量标准。