扶正化瘀方对肝纤维化大鼠弹力蛋白酶表达的影响

  　迄今为止，对弹力蛋白酶是否参与肝纤维化的形成与降解过程知之甚少。细胞外基质（ECM）的弹力纤维随着肝纤维化的进展逐渐增加[1]。我们曾报道正常大鼠肝细胞、肝窦壁内皮细胞等均有弹力蛋白酶mRNA表达[2]。本研究进一步观察了弹力蛋白酶在肝纤维化组织中的表达以及抗肝纤维化药扶正化瘀方对弹力蛋白酶表达的影响。
　　

    一、材料与方法
　　1. 肝纤维化动物模型及扶正化瘀方制备：Wistar雄性大鼠，140～160g，造模方法详见文献[3]。扶正化瘀方药物组成同国家三类新药扶正化瘀胶囊（国药准字号20020073），配制成含生药0.369g/ml的混悬液。
　　2. 弹力蛋白酶Ⅱ探针制备及原位杂交：以大鼠胰腺丝氨酸弹力蛋白酶ⅡmRNA碱基排列中第271～288与第776～795之间的核苷酸作为引物，制成地高辛素标记的RNA探针进行原位杂交，具体方法参见文献[2, 4，5]。
　　3. 胰腺弹力蛋白酶蛋白印迹杂交及其活性测定：肝组织总蛋白30μg以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜，兔抗猪弹力蛋白酶抗体反应。活性测定方法参见文献[6]。
　　4. 其他：Jamall氏法测定肝组织羟脯氨酸（hydrox-yproline, Hyp）；维多利亚蓝染色法行弹力纤维染色；天狼星红染色法行胶原纤维染色。胶原纤维增生程度按文献[7]方法进行分期半定量判断。
　　5. 统计学处理：用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，计数资料用Radit分析。
　　

    二、结果（略）
　　

    三、讨论
　　肝组织Hyp含量、肝组织病理学、肝功能及大体病理均表明二甲基亚硝胺可制备大鼠肝纤维化模型。由于使用正义探针原位杂交呈阴性反应，证明所制备的反义探针是成功的[2]。本研究进一步证实在正常大鼠肝组织中，不仅有弹力蛋白酶mRNA表达[2]，同时有弹力蛋白酶蛋白及其活性表达。
　　肝纤维化模型大鼠肝组织弹力纤维、胶原纤维及Hyp含量均有明显增加，与此同时，假小叶内肝细胞的弹力蛋白酶的mRNA表达及肝组织中的弹力蛋白酶活性有所减少。提示二甲基亚硝胺通过抑制弹力蛋白酶表达，破坏了ECM合成与降解的动态平衡，导致ECM代谢过程中合成大于降解，从而促进了肝纤维化的形成。由于扶正化瘀方组大鼠肝组织弹力蛋白酶mRNA及其活性表达介于正常组与模型组之间，其肝纤维化程度也居于上述两组之间，提示扶正化瘀方药物也许通过上调弹力蛋白酶表达促进了肝纤维化的降解，从而在某种程度上阻止了肝纤维化的进一步形成。弹力蛋白酶mRNA、蛋白及其活性在各组间的表达强度基本一致、并与各组肝纤维化的程度呈反比关系，据此可以初步认为弹力蛋白酶是保持ECM代谢动态平衡的因素之一，参与了肝纤维化形成与降解的代谢过程。
既往研究表明，扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制主要有拮抗肝星状细胞的活化、影响胶原代谢酶活性以促进胶原降解，同时具有抗肝窦毛细血管化、抗肝损伤、保护肝细胞的作用[8]。肝星状细胞表达弹力蛋白的功能优于肝细胞[9]，据此可推测扶正化瘀方通过拮抗肝星状细胞的活化，在影响胶原纤维代谢的同时，也影响了弹力纤维的代谢，使得金属蛋白酶与丝氨酸弹力蛋白酶协同作用，抑制了肝纤维化的进展。
　　本研究初步证实弹力蛋白酶在一定程度上参与了肝纤维化形成与降解的代谢过程，扶正化瘀方通过上调弹力蛋白酶表达可在某种程度上抑制肝纤维化的进一步形成。

TAG：胰腺弹力蛋白酶蛋白 胶原纤维