地牡宁神口服液是由熟地黄、枸杞子、山茱萸等11味中药组成,地牡宁神口服液具有滋补肝肾,宁神益智的作用。原质量标准是采用薄层扫描法测定知母中的拔葜皂苷元的含量,因薄层扫描法专属性、稳定性、重现性均较差,故我们对其方法进行了改进。山茱萸具有补益肝肾的作用,其中化学成分马钱苷有增强免疫的作用,与地牡宁神口服液的功能主治相吻合,因此我们采用高效液相色谱法测定地牡宁神口服液中马钱苷的含量,作为控制地牡宁神口服液的质量指标。
1 仪器与试药
LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津,SPD-10Avp紫外检测器,CLASS—VP色谱工作站),uV-2501型紫外分光光度计(日本岛津),离心机(Abbott Laboratories,德国),SD-350H型超声波清洗器(韩国)。马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:111640—200401),地牡宁神口服液为市售样品(山东烟台西苑制药厂生产),甲醇为色谱纯(天津市四友生物医学技术有限公司,20040426101),甲酸为分析级(江苏益林化工厂,980904),水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:SHIMADZU Shim-pack vp-ODS(250 mm×4.6mm,5um),预柱:SHIMADZU Shim-pack vp-ODS(10 mm×4.6 mm,5u m);流动相:甲醇-水-甲酸(30:69:1),检测波长:240 nm,柱温:30℃ ,流速:1.0 ml•min~,进样量20 ul。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取马钱苷对照品适量,用50% 甲醇溶解并稀释配制成30ug•ml-1的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取市售样品地牡宁神口服液(批号:20041201)3支(10 ml/支),混匀,精密量取10.0 ml置具塞锥形瓶中蒸干,放冷,精密加入50% 甲醇25 ml,密塞,称定重量,超声15 min,加热回流1 h,放冷,再称定重量,用50% 甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液10 ml,置中性氧化铝柱(100~200目,4 g,内径1 cm,干法装柱)上,用40% 甲醇50 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加50% 甲醇适量使溶解,并转移至10 ml量瓶中,加50% 甲醇稀释至刻度,摇匀,过滤,即得。
2.2.3 阴性样品溶液的制备取地牡宁神口服液(不含山茱萸)10 ml,置具塞锥形瓶中蒸干,按“2.2.2”供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
2.3 专属性考察
在“2.1”色谱条件下,分别吸取阴性样品溶液、对照品溶液和供试品溶液各20ul,注入液相色谱仪,记录色谱图。可见在与马钱苷对照品峰相应的位置上,供试品溶液图中有相应的色谱峰,而在阴性样品溶液色谱图中相应保留时间处无此峰,理论板数按马钱苷峰计算应不低于3 000。见图1(略)。
2.4 线性关系的考察
精密称取马钱苷对照品适量,加50%甲醇使完全溶解,配制成0.256 mg•ml 的对照品溶液。再加50% 甲醇配制成0.128,0.064,0.032,0.016,0.008 mg•ml 的对照品溶液。精密吸取各浓度的对照品溶液20ul,注入液相色谱仪,测定峰面积,以峰面积积分值Y为纵坐标,马钱苷对照品的进样量x为横坐标,经线性回归,回归方程Y=1.66×10^6X+1.13×10^5,r=0.999 8(n=6),表明马钱苷进样量在0.16~2.56 g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取同一浓度的对照品溶液(0.032 mg•ml),连续进样5次,进样量20ul,计算峰面积的RSD% =1.3(n=5),结果表明精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号地牡宁神口服液样品(批号:040528)5份,按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,测定每份的含量,RSD 1.2%(n=5),结果表明重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一批号地牡宁神口服液供试品溶液(批号:040528),分别在0,2,4,6,8,12 h进样测定马钱苷峰面积,RSD=1.5%(n=6)。结果表明制备的供试品溶液在12 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
精密量取已知含量同一批号地牡宁神口服液的样品(批号~040528,马钱苷含量1.87 m 支)5份,各2.0 ml,分别精密加入马钱苷对照品0.30 mg,按供试品溶液的制备方法制备供试液,进样20ul按上述色谱条件测定,计算马钱苷回收率,结果见表1(略)
2.9 样品含量测定(n=3)
取市售样品地牡宁神口服液(批号:20050526、20050608、20050620)三个批号各3支(10 ml/支),分别混匀,各精密量取10 mll,分别置锥形瓶中蒸干,按照“2.2.2”项中供试品溶液制备方法制备供试品溶液,精密吸取20 l注入液相色谱仪中,每批测定3次,平均含量分别为1.76,1.85,1.81 m 支。
3 讨论
3.1 质量控制方法的改进
原标准中方法为薄层扫描法测定知母中的拔葜皂苷元,因薄层扫描法专属性、稳定性、重现性均较差,所以,我们采用高效液相色谱法测定地牡宁神口服液中马钱苷的含量做为质量控制指标。
3.1 波长的选择
文献中马钱苷含量测定方法中的波长为236 am,《中国药典))2005年版中六味地黄丸测定马钱苷的波长为236am,《中国药典))2005年版中山茱萸药材含量测定中波长为240 am。我们取对照品溶液适量在紫外可见分光光度仪中扫描,记录谱图,从图中可看出,对照品溶液在240 nnl处有最大吸收,故拟定马钱苷的紫外吸收波长为240 am。
3.2 流动相的选择
以甲醇.水(30:70)为流动相 ],试验中发现样品色谱图中马钱苷峰峰形不佳,经过调整流动相的比例,峰形都不佳,最后调整流动相为甲醇.水.甲酸(30:69:1)后,峰形得到改善。