递法明片为法国进口的植物药制剂 ,其中含有欧洲越橘果提取物。欧洲越橘果即黑果越桔,主要分布于欧洲大部分地区,花青苷色素为其中的主要有效成分之一。花青苷具有促进视网膜上视红素的再合成、增强人眼视力、改善视觉敏锐度、加快黑暗环境适应能力的功能,同时还可以防止毛细血管脆裂,改善循环系统机能 。越橘中花青苷种类较多,受对照品的限制。难以一一测定。研究表明,欧洲越桔果中的花青素糖苷衍生物主要以花青素一葡萄糖苷、花青素一半乳糖苷、花青素一阿拉伯糖苷等组成,测定时经稀盐酸水解,以上糖苷均水解成花青素苷元的盐酸盐.再以氯化花青素作为对照品采用高效液相色谱法进行测定。本方法可作为递法明片质量标准中的含量测定方法。
仪器与试药:安捷伦1100型高效液相色谱仪;庚烷磺酸钠,分析纯;乙腈,HPLC级;所用其他试剂均为分析纯。氯化花青素对照品:,批号94082512(标示纯度为100%);递法明片,法国乐康一美的澜制药厂提供。
色谱条件:色谱柱:Alhima C.8柱(4.6 mm x 150 mm,5 m),流动相:5 mmol•L 庚烷磺酸钠溶液一乙腈一冰醋酸(73:27:1.5);流速:1.0 mL•min~;柱温:40 cc;检测波长:530 nm。氯化花青素与相邻杂质峰分离度大于1.5,理论塔板数按氯化花青素峰计算,应不低于2000。色谱图见冈l。
溶液配制:对照品溶液精密称取氯化花青素对照品适量,加盐酸甲醇(3—10)溶液制成每1 mL含氯化花青素3.92 g的溶液,即得(避光)。供试品溶液取递法明片的细粉0.5 g,精密称定,置具塞离心管中,加正己烷15 mL,超声处理3min,离心(4000 r•min )5 rain,小心倾去上清液,残渣加正己烷15 mL,再同法操作3次,上清液弃去,残渣挥干溶剂,加盐酸甲醇(3—10)溶液15 mL,
超声处理2 min使溶解,转移至烧瓶中,用盐酸甲醇(3—10)溶液15 mL分次洗涤容器,洗液一并转入烧瓶,置90 水浴中回流1 h,立即冷却,用盐酸甲醇(3 —10)溶液定量转移至50 mL棕色量瓶中,并稀释至刻度,摇匀。用微孔滤膜(0.45 m)滤过,取续滤液,即得。
水解条件的考察:本研究采用正交实验法,确定最佳酸水解条件。正交实验方案设计采用L9(3 )正交表,以测得的氯化花青素含量作为指标。
试验安排与试验结果:分别取样品细粉适量,照上述“3.2”项下的制备方法,按L9(3 )正交表试验安排进行试验,结果表明,对水解的主要影响因素为水解温度和酸浓度,水解时间在选定范围内,对结果影响不大。最佳水解条件为A3B3C3,从易操作性考虑,可将最佳条件定为A3B2C3。
氯化花青素的紫外可见光谱扫描图谱显示,存在276 nm和530 nm 2个最大吸收峰。由于在530 nm处测定时杂质干扰少,灵敏度高,故选择530 lqm做为检测波长。