【摘要】目的:动态观察
阿德福韦酯治疗HBeAg阳性
慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性T淋巴细胞功能和非特异性免疫细胞的改变,探讨其与HBeAg血清学阴转的相关性;以进一步探讨抗病毒治疗的免疫机制。
方法:20例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者予以阿德福韦酯治疗48周,酶联免疫斑点试验检测分泌干扰素γ的HBV特异性CD4+T淋巴细胞频数,流式细胞术检测调节性T淋巴细胞(Treg)数量和自然杀伤细胞活化受体NKG2D的表达。根据资料不同采用t检验或Mann-Whitney U检验进行统计学分析。
结果:治疗48周时有6例(占30%)患者出现HBeAg的转阴,分为HBeAg阴转组(n=6)和HBeAg未阴转组(n=14)。伴随病毒载量的下降,HBeAg阴转组治疗后HBcAg特异性CD4+T淋巴细胞分泌IFN γ和细胞增殖的能力均较治疗前增强,同时也较HBeAg未阴转组增强,48周时(外周血单核细胞中的斑点形成细胞数)的(661.25±281.97)×10-6对比0周时的(280.75±104.33)×10-6,P=0.045,差异有统计学意义;而HBeAg未阴转组治疗前后无改变。同时Treg数量逐渐下降,4周后趋于稳态;而NKG2D在治疗后12周开始持续上升,48周较基线值显著增加(P=0.000)。Treg和NKG2D的表达趋势在HBeAg阴转组和未阴转组间差异无统计学意义。
结论:阿德福韦酯抗病毒治疗过程,伴随病毒负荷下降,部分患者HBV特异性T淋巴细胞功能呈一过性增强,与HBeAg阴转密切相关;进一步证实HBV特异性T淋巴细胞功能的恢复是清除病毒,促进HBeAg血清学转换的重要因素。
慢性HBV感染过程,机体的免疫调节系统错综复杂,包括T淋巴细胞(简称T细胞)、自然杀伤(NK)细胞以及调节性T细胞(regulate T cell,Treg)、树突状细胞等免疫细胞密切相关、相互调节。研究证实HBV特异性T细胞和NK细胞作为抗病毒的重要免疫细胞在急性乙型肝炎患者清除病毒,实现持久免疫控制中起重要作用。但对其在慢性乙型肝炎发病过程中的作用所知甚少;而调节性T细胞具有负相调节T细胞和NK细胞等免疫细胞的功能。在慢性HBV感染免疫耐受形成中起作用。近年的研究结果显示,核苷(酸)类似物抑制病毒复制控制HBV感染的过程,有部分患者可以实现HBeAg血清学转换,达到持久免疫控制;如何解释相同的药物却有不同的临床结局,实现免疫控制的这部分患者,其宿主免疫细胞功能的作用机制并不明确。
本研究通过动态观察阿德福韦酯治疗HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者,伴随病毒下降的过程,外周血特异性(HBV特异性CD4+T细胞功能)和非特异性免疫细胞[Treg及MK细胞活化受体(NKG2D)表达]的改变,与HBeAg血清学应答的相关性。进一步探讨病毒负荷下降对宿主免疫功能的影响,对深入研究治疗应答的免疫学机制,持久免疫控制HBV具有重要的临床意义。
资料与方法
1.研究对象和治疗方法:研究入选符合2005年中华医学会感染病学分会及
肝病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者50例。均为初治患者,近半年内未服用任何抗病毒和免疫调节药物。排除合并其他肝炎病毒感染,如HAV、HCV等;其他肝病,如酒精性肝病、自身免疫性肝病、药物及中毒性肝病;所有患者均接受阿德福韦酯10 mg/d治疗,随访研究48周。在治疗前、治疗后4周、12周、24周、36周、48周及出现HBeAg消失时留取血样(肝素钠抗凝全血)作为随访检测标本,分离外周血单核细胞冻存,分批进行以下的检测。HBsAg阴性的健康对照者8例为对照组。入选患者均签署知情同意书,研究方案通过福建医科大学伦理委员会审查。
2.HBV特异性T细胞功能检测:(1)FICOLL-HYPAQUE(聚蔗糖-泛影葡胺,F-H)密度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC):无菌采集抗凝外周血15 ml,磷酸盐缓冲溶液(PBS)等体积稀释后,吸取细胞稀释悬液缓慢加至等体积的淋巴细胞分离液上,室温下450×g离心20 min。分离得到的PBMC,PBS液洗涤2次;最后用含10%胎牛血清的1640培养液重悬,用2%锥虫蓝染液检测细胞活性,活细胞在95%以上。部分细胞冻存备用。(2)细胞冻存和复苏。(3)BrdU标记法测定T细胞增殖:按BrdU淋巴细胞增殖试验试剂盒说明书操作,步骤如下:实验设为阳性对照植物血凝素组(PHA 10 μg/ml)、实验组分别为HBcAg组(2 μg/ml),阴性对照组,空白对照组;每组设三个复孔,将新鲜分离的PBMC以2×105个/孔接种在96孔细胞培养板上,同时加入刺激的抗原,37℃培养箱孵育48 h。加入BrdU labeling solution标记孵育22 h。洗板、显色,以DU800分光光度仪分析,结果以490 nm波长测量的吸光度(A值)表示。SI值:(实验组-空白组)/(阴性对照组-空白组)。(4)酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测分泌IFN γ的HBV特异性CD4+T淋巴细胞频数:实验设为阳性对照组(PHA 10 μg/ml),实验组(HBcAg 2 μg/ml),阴性对照组及空白对照组,每组设3个复孔。PBMC均为随访治疗过程冻存后复苏的细胞。具体操作见试剂盒说明书,以稀释后的抗IFN γ抗体(购自美国BD Pharmingen公司)包被底部为聚偏氟乙烯的96孔培养板,4℃过夜。次日洗板、封闭;加入所配刺激原和复苏后的PBMC 2×105个/孔;终体积为200 μl/孔。经孵育、洗板、标记、显色等,采用美国CTL公司Immunospot Analyzer Series3分析仪上读取孔内斑点数。每一个斑点代表一个分泌IFN γ的细胞,计数斑点形成细胞(SFC)数,记录数据为实验孔测得值-阴性对照孔测得值,以SFC除以106个PBMC为单位计算。
3.检测外周血Treg细胞和NK细胞表面受体NKG2D的表达:取肝素钠抗凝全血2管,分别加入CD4- FITC、CD25- PerCP Cy5.5、CD127-PE抗体(购自美国BD Pharmingen公司),另一管加入CD3- FTIC-CD16+CD65- PE、NKG2D- APC抗体(购自美国BD Pharmingen公司);混匀后室温避光孵育30 min,加入红细胞裂解液20 ml,避光孵育15 min后,PBS 2ml洗2编,最后用10 g/L多聚甲醛300 μl重悬固定。使用FACS Calibur仪器(购自美国BD公司)进行流式细胞检测,收集细胞数(1~1.5)×105个,用美国BD公司的Cell Quest软件进行分析。分别分析CD4+CD127lowCD25highTreg占CD4+T细胞的比例,CD3-CD16+CD56+NKG2D+细胞占外周血PBMC的比例,同时每份标本均设自身同型对照。
4.统计学方法:使用SPSS 13.0软件对数据统计处理。计量资料数据用均数±标准差(x(-)±s)表示,连续变量检测前进行正态性检验,正态分布资料采用独立样本t检验,非正态分布用Mann-Whitney U检验比较组间差异,相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.临床资料:20例HBeAg阳性的CHB患者,其中男性16例,女性4例。年龄20~41岁,平均(26.7±8.3)岁。HBV DNA(6.71±0.81)log10拷贝/ml,ALT(165±49)U/L、AST (115±63)U/L。阿德福韦酯治疗48周后,CHB患者血清HBV DNA下降了2~5 log10拷贝/ml;20例CHB患者有17例血清HBV DNA低于检测值下限(HBV DNA<1.0×103 拷贝/ml),其余3例患者血清HBV DNA检测仍阳性。治疗12周时血清ALT、AST水平明显下降,大部分恢复正常(85%,17/20),治疗至48周时全部正常。20例CHB患者有6例(占30%)出现HBeAg阴转,其中3例(占15%)出现-HBe,实现血清学转换。无一例耐药、失访。根据治疗48周后HBeAg阴转的发生,将患者分为两组:分别为HBeAg阴转组(组1,n=6),HBeAg未阴转组(组2,n=14)。比较两组患者在年龄、性别、治疗前HBsAg、HBV NDA及ALT、AST水平间的差异没有统计学意义。两组在治疗前后病毒学和生物化学指标见表1。HBsAg阴性健康对照组8例(男性5例,女性3例),年龄20~30岁。
2.HBV DNA载量下降后外周血HBcAg特异性CD4+T细胞的功能:(1)比较阿德福韦酯治疗前后一年的各随访点,可见随着HBV DNA的下降,HBeAg阴转组分泌IFN γ的HBV特异性CD4+T细胞的频数呈逐渐增加的趋势,12周时达到第一个高峰,与治疗前比较[12周时为(629.75±166.99)×10-6对比0周时的(280.75±140.33)×10-6,P=0.012],至36周和48周时(即出现HBeAg阴转和转换时),分泌IFN γ的细胞频数再次显著升高,与治疗前比较[36周时的(783.75±305.49)×10-6对比0周时的(280.75±140.33)×10-6,P=0.021和48周时的(661.25±281.97)×10-6对比0周时的(280.75±140.33)×10-6,P=0.045];而HBeAg未阴转组表现为治疗早期(12周)的轻微增加,与治疗前差异无统计学意义。HBeAg阴转组IFN γ的CD4+T细胞频数在治疗前后(各时间随访点)均高于HBeAg未阴转组,尤其在治疗前、治疗后12周、24周、36周、48周显著增加,两组间差异有显著的统计学意义,P<0.05(图1)。(2)外周血HBcAg特异性T细胞的增殖功能:HBeAg阴转组HBcAg特异性T细胞增殖能力在治疗24周时一过性增高,与基线差异有统计学意义(24周SI值为2.19±0.58对比0周的1.40±0.39,P=0.038);而未阴转组治疗前后差异无统计学意义,P值均>0.05。两组间比较,24周时HBeAg阴转组的T性别增殖能力较未阴转组增高,差异有统计学意义(HBeAg阴转组SI值为2.19±0.58对比未阴转组的1.48±0.63,P=0.035)同步比较,阳性对照组PHA刺激PBMC后的细胞增殖能力在HBeAg阴转组和未阴转组间差异无统计学意义,P>0.05。各组治疗前后的细胞增殖能力差异无统计学意义,P值均>0.05。
3.外周血Treg的表达:随HBV DNA的下降,Treg也逐渐下降;在病毒下降的快速期(0~4周),Treg明显下降(0周的10.78%±2.15%对比4周的8.86%±2.30%,P=0.037),纵向分析可见治疗4周以后进入了相对平台期,比较4周、12周、24周及48周各时间点Treg的表达,各时间点的差异无统计学意义。HBeAg阴转组和HBeAg未阴转组间差异无统计学意义,P值均>0.05。随HBV DNA的下降,Treg也逐渐下降,两者之间呈正相关性趋势(r=0.808,P=0.000),见图2、3。
4.外周血NK细胞活化受体NKG2D的表达:以CD3-CD16+CD56+NKG2D+代表NK细胞NKG2D的表达(图4),CHB患者NK细胞表面NKG2D的表达显著低于健康对照组(3.95%±1.15%对比18.62%±5.36%,P=0.005)。ADV治疗后0~12周升高差异有统计学意义(12周的8.12%±4.74%对比0周的3.95%±1.15%,P=0.008;12周后各时间点NKG2D的表达较治疗前升高,差异有统计学意义(P=0.02);至48周达到峰值,较基线值约升高了5倍(48周时的17.52%±6.81%对比0周时的3.95%±1.15%,P=0.000,图5)。HBeAg阴转组和HBeAg未阴转组NK细胞NKG2D的表达在各个时间点的变化趋势一致,2组间差异无统计学意义。NKG2D的表达和HBV DNA间呈负相关(r=-0.734,P=0.000,图5)。
5.抗病毒治疗过程中,NKG2D与Treg动态变化的相关性结果显示二者呈相反的变化趋势,但相关性分析显示二者间无相关性。
讨论
研究发现抗病毒治疗的过程,伴随有部分免疫细胞功能的恢复,免疫细胞间通过相互调节改善免疫微环境,影响抗病毒的临床结局。目前对宿主细胞免疫的抗病毒作用机制的认识非常有限。
纵向地观察阿德福韦酯治疗48周,伴随HBV DNA的下降,HBeAg阴转的患者出现HBV特异性T细胞免疫功能的恢复;表现为HBeAg阴转组在抗病毒治疗后HBV特异性T细胞分泌细胞因子IFN γ和细胞增殖功能较治疗前显著增强,同时也较HBeAg未阴转组显著增强。由此可见显著的免疫功能的恢复主要见于HBeAg阴转的患者,已有的研究结果显示病毒负荷的下降促使部分患者HBV特异性T细胞功能恢复;因此推测,治疗后部分特异性细胞免疫功能的恢复通过非细胞毒途径如分泌IFN γ进一步清除病毒,实现HBeAg阴转。未实现HBeAg阴转的这一组患者,没有出现类似的T细胞免疫功能的恢复,T细胞应答仍然低下,病毒载量和HBeAg表达均未阴转。
细胞免疫调节的网络中,特异性T细胞的功能受到多种免疫细胞和免疫因子的调控,如Treg细胞、NK细胞及PD-1等。本研究中我们发现阿德福韦酯治疗后,HBV DNA快速下降期(0~4周),外周血Treg的比例也显著下降,二者间呈正相关,同时,抗病毒的HBV特异性T细胞功能逐渐恢复,这与Stoop等的研究是一致的,提示病毒负荷下降后,Treg细胞的减少,抑制作用下调,有利于特异性细胞免疫应答的恢复来清除病毒。进入HBV DNA的缓慢下降期后,Terg数量没有继续下降,而是进入了相对平衡期;这可能是宿主自身免疫调节作用,到一定程度时避免Treg过度调节导致自身免疫病理的发生。这种情况类似于急性肝炎发病初期较低的Treg数量有利于特异性细胞免疫反应对病毒的清除,而恢复期Treg数量的增加则有利于抑制炎症反应对感染组织的损伤。Treg细胞的改变在HBeAg阴转组和未阴转组间无差异,因此,Treg调节T细胞的功能,仅是免疫调节的一部分,并不能在免疫清除中起绝对作用。
NKG2D是NK细胞的活化受体,它的表达与NK细胞活化功能紧密相关。NK细胞通过活化受体与病毒感染细胞表面配体特异性识别诱导感染细胞死亡;在病毒感染早期清除病毒及免疫诱导T细胞成熟方面有着重要作用。本研究中慢性乙型肝炎患者NK细胞NKG2D的表达较健康人低,NKG2D在CHB患者的低表达,反映了NK细胞的部分活化能力处于抑制状态,CHB患者天然免疫NK细胞功能不全。已有研究提示慢性乙型肝炎患者NK细胞功能不全,不足以清除病毒,却与肝细胞的损伤直接相关。本研究结果显示,抗病毒治疗后,随着HBV DNA和HBeAg水平的下降,NKG2D的表达逐渐增高,并在48周时达到最高峰。HBV DNA下降与NKG2D表达上调间形成负性相关。由此可见,慢性HBV感染的高病毒负荷对NK细胞的活化有抑制作用,降低病毒负荷后,外周血NK细胞活性增强。
本研究中,同步观察抗病毒治疗HBV DNA下降的过程,外周血Treg细胞比例下降,并出现NK细胞NKG2D的表达上调和部分HBV 特异性CD4+T细胞功能的恢复,NK细胞、T细胞与Treg间的动态变化呈负相关。已有研究结果提示,Treg通过TGF-β的途径,抑制NK细胞的功能,Treg细胞可下调NK细胞上NKG2D的表达。据此推测,病毒被抑制,Treg频数下降有利于T细胞功能的恢复,同样有利于NK细胞活性的恢复。NK细胞功能的恢复,是病毒载量下降直接影响,还是Treg下降后对NK细胞的抑制减弱,从而促进其功能恢复,还需进一步的研究。
本研究结果显示非特异性免疫(Treg和NK)细胞的改变与HBeAg血清学阴转无明显相关性,非特异性免疫仅是改变了机体的免疫环境,促进了特异性免疫应答的恢复,并不直接影响HBeAg血清学转换。而HBV特异性T细胞功能的恢复与HBeAg血清学转换密切相关,进一步证实决定HBV感染转归的主要因素是HBV特异性T细胞免疫应答的强弱。
以上来源:郑琦,朱月永,陈靖,刘豫瑞,游佳,曾达武,林苏,江家骥。《抗病毒治疗后慢性乙型肝炎患者外周血免疫细胞的改变与HBeAg血清学阴转的关系》。《中华肝脏病杂志》。2012年11月第20卷第11期