盐酸司来吉兰(S
elegiline hydrochloride)为选择性β型单胺氧化酶抑制剂,能抑制多巴胺受体突触对多巴胺的再吸收,增加多巴胺的储存,临床上用于巴金森氏及其综合症,其分子结构见图1,其中含有1个手性中心,有(D),(L)2种光学异构体。大量药效学研究结果表明其右旋异构体有药效,而左旋异构体无效。英国药典1998年版收载用HPLC法使盐酸司来吉兰手性分离,检查左旋体的含量,控制药品的质量。高效毛细管电泳法(HPCE)与高效液相色谱法(HPLC)相比较,柱效高,消耗低,成功应用于药物手性分离已有报道,但用HPCE法对D-L盐酸司来吉兰进行手性分离的研究尚未见报道,本文通过加入HP-β-CD手性选择剂使其光学异构体得到完全分离。
1 仪器与试剂
仪器:Beckman P/ACE 5500型全自动毛细管电泳仪配备二极管阵列检测器和Gold软件数据工作站。中性毛细管柱50 μm×56 cm(有效长度49 cm)。
试药:磷酸氢二钾、磷酸、氢氧化钾均为分析纯;重蒸馏水;α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)(Sigma试剂);D-L盐酸司来吉兰(光学纯),法国赛诺菲公司提供。
盐酸司来吉兰片(批号6651197,6760298,6850689)赛诺菲民生制药公司。
对照品溶液的配制:称取D-L盐酸司来吉兰约8 mg,用水溶解并稀释至浓度为0.4 mg.L-1(1)和0.02 mg.L-1(2)。
磷酸盐缓冲液的配制:精密称取磷酸氢二钾17.4 g至100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,浓度为100 mmol.L-1磷酸氢二钾溶液,备用。
2 实验条件
工作电压:30 kV,检测波长:200 nm,柱温:15 ℃,阳极气压进样3 s,每日毛细管依次用0.1 mol.L-1盐酸溶液冲洗2 min,水冲洗2 min和运行缓冲液冲洗5 min,每次进样前均用水和运行缓冲液各冲洗2 min。
3 结果
取D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(2)在上述实验条件下,以HP-β-CD浓度为20 mmol.L-1的50 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 4.7)为运行液,进行电泳,记录电泳图;另称取盐酸司来吉兰片细粉适量,用水溶解并过滤,滤液稀释至浓度为2 mg.L-1的溶液,在上述实验条件下电泳,记录电泳图,见图2,按外标法以峰面积计算,结果3批盐酸司来吉兰片中L-盐酸司来吉兰含量均小于0.5%。
4 讨论
4.1 手性选择剂类型和浓度对对映体分离的影响
取α-CD、β-CD和HP-β-CD适量,分别制成浓度为20 mmol.L-1的50 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 4.7),用D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(1)在上述实验条件下分别以上述缓冲液为运行液,进行电泳,结果见图3。以HP-β-CD为手性选择剂,使D-L盐酸司来吉兰得到完全分离(D:14.7 min,L:15.2 min);以β-CD为手性选择剂,仅得到部分分离(D:9.3 min,L:9.4 min);以α-CD为手性选择剂,仅出单峰(D-L:9.7 min),其对映体不能分离,说明在上述实验条件下,HP-β-CD比α-CD和β-CD具有更好的手性识别能力,HP-β-CD的空腔与D-L盐酸司来吉兰相匹配,所以选择HP-β-CD为D-L盐酸司来吉兰分离的手性选择剂。
用HP-β-CD浓度分别为2,10,20,30,40,50 mmol.L-1的50 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH调至4.7)作为运行液,在上述实验条件下,取D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(1)进样,当HP-β-CD的浓度为2 mmol.L-1时,其对映体不能分离,仅出单峰,当浓度为10 mmol.L-1时,仅部分分离,浓度为20~50 mmol.L-1均能达到基线分离,但浓度为50 mmol.L-1时,分离最佳。当HP-β-CD浓度增加时,D-L盐酸司来吉兰的迁移时间增加趋势见图4。当HP-β-CD浓度为20 mmol.L-1时,迁移时间较短,D-L盐酸司来吉兰对映体分离较好。
4.2 运行液的酸度对对映体分离的影响 配制HP-β-CD浓度为20 mmol.L-1,滴加磷酸使pH分别为3.5,4.0,4.5,4.7,5.0,5.3的50 mmol.L-1磷酸盐缓冲液作为运行液,用D-L盐酸司来吉兰对照品溶液(1)进样,按上述实验条件试验,当运行液的pH值改变时,D-L盐酸司来吉兰峰的迁移时间情况见图5。当pH为3.5时,呈单峰,当pH为4.0时,对映体仅部分分离,当pH为4.5~5.0时迁移时间呈平台,pH为4.7时,迁移时间最短,对映体得到最佳分离,选择为最佳运行液酸度。
4.3 运行电压和柱温对D-L盐酸司来吉兰对映体分离的影响
用20 mmol.L-1 HP-β-CD的50 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH为4.7)作运行液,当工作电压从30 kV减少至10 kV时,电流从30 μA减少至10 μA,D-L盐酸司来吉兰峰迁移时间延长,峰也展宽,对映体分离度变差,选择最佳工作电压为30 kV。
当柱温从15 ℃增加至40 ℃时,运行电流从28 μA增加至48 μA,D-L盐酸司来吉兰峰迁移时间缩短,因焦耳热背景噪音增加,对映体分离度差,所以选择15 ℃为最佳柱温。
4.4 检测波长对分析的影响 盐酸司来吉兰在215 nm处有最大吸收,在200 nm处有极大末端吸收,但运行缓冲液无吸收,当用200 nm作检测波长时,峰响应值较215 nm处增加约1倍,使浓度为0.02 mg.mL-1的盐酸司来吉兰溶液的峰响应大于噪音的20倍左右,提高了最低定量限。故将盐酸司来吉兰的检测波长定