肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,AIS)是一种由于大脑皮质、脑干、脊髓的运动神经元进行性变性,导致肌肉无力、萎缩、言语、吞咽、呼吸功能障碍的神经变性疾病。尽管患者的临床表现和病情的进展速度存在相当程度的个体差异,但无一例外呈进行性加重,60%以上患者在起病3年内死亡,约有10%生存期可达8年以上。有5%~10%的AIS患者是家族性ALS(familial ALS,fALS),而另外90%~95%的患者无家族史,为散发性ALS(sporadic ALS,sALS)。大约有20%的fAIS和1%的sAIS与超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变相关,但大部分ALS患者的遗传病因不明,ALS的发病机制也尚未明确。近年来,随着全基因组关联研究(GWAS)和第2代测序技术的广泛应用,以及分子生物学的飞速发展,在ALS的遗传学、发病机制、生物标志物等方面都有了长足的进展,与此同时也迎来了新的挑战,我们拟就这些方面作一综述。
一、肌萎缩侧索硬化遗传学的进展与挑战
继SOD1基因后,全世界的研究人员又陆续发现了12个与ALS相关的基因(表1):
表1 已知与家族性ALS有关的基因和基因座
ALS亚型 |
基因 |
基因座 |
蛋白 |
ALS1 |
SOD1 |
21q22.11 |
SOD1 |
ALS2(少年型) |
ALS2 |
2q33-q35 |
alsin |
ALS3(常染色体显性) |
无记录 |
18q21 |
无记录 |
ALS4 |
SETX |
9q34 |
Senataxin |
ALS5 |
SPG11 |
15q15.1-q21.1 |
spatacsin |
ALS6 |
FUS |
16p11.2 |
FUS |
ALS7 |
无记录 |
20p13 |
无记录 |
ALS8 |
VAPB |
20q13 |
VAPB |
ALS9 |
ANG |
14q11.1-q11.2 |
ANG |
ALS10 |
TARDBP |
1p36.22 |
TDP-43 |
ALS11 |
FIG4 |
6q21 |
聚磷酸肌醇磷酸盐 |
ALS12 |
OPTN |
10p14 |
Optineurin |
ALS13 |
ATXN2 |
12q23-q24.1 |
Ataxin-2 |
ALS-X |
UBQLN2 |
Xp11.21 |
Ubiquilin-2 |
ALS合并额颞叶痴呆 |
C9orf72 |
9p21.1 |
功能不明的C9orf72 |
ALS合并包涵体肌炎 |
VCP |
9p13 |
移行的内质网ATP酶 |
注:ALS:肌萎缩侧索硬化;SOD:超氧化物歧化酶
膜泡关联膜蛋白相关蛋白B(vesicle-associated membrane protein-associated protein B,VAPB)基因、senataxin(SETX)基因、ALS2基因、FIG4基因、共济失调蛋白-2(ataxin 2,ATXN2)基因、SPG11基因、血管生成素(angiogenin,ANG)基因、反式激活反应-DNA结合蛋白(TAR DNA binding protein,TARDBP)基因、肉瘤熔合(fused in sarcoma,FUS)基因、视神经蛋白(optineurin,OPTN)基因、含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein,VCP)基因、泛素-2(ubiquilin2,UBQLN2)基因。加上SOD1基因,这些基因的突变占所有fALS患者的40%~45%,但只占sALS患者的4%~5%。最近,国外又传来令人振奋的消息,通过GWAS和第2代测序技术,2个独立的研究小组发现位于C9FOR7基因非编码外显子1a和1b间的内含子上的一个异常的GGGGCC核苷酸六聚体重复序列与ALS相关,横断面研究和以人口为基础的队列研究显示此异常的核苷酸重复序列占fALS患者的37.6%~41%和sALS患者的5%~6%。随着新的肌萎缩侧索硬化(ALS)致病基因不断被发现,在越来越多的ALS患者,尤其是明显的sALS患者中发现致病基因突变携带者,提示遗传因素在ALS发病中所起的作用远远超出我们的预想。遗传学研究最重要的进展莫过于在家族性和散发性额颞叶变性(FTLD)患者中均发现了ALS相关的TARDBP、FUS、OPTN、VCP和C9FOR72基因的突变携带者,尤其是C9FOR72基因的GGGGCC核苷酸六聚体异常重复序列,出现在25.1%的家族性FTLD患者和5.8%的散发性(FTLD)患者。临床研究显示多达50%的ALS患者可以出现轻度额叶执行功能障碍,有一些可以发展为明显的额颞叶痴呆(FTLD);而FTLD进展期的患者也可出现ALS的临床表现, 而且,在同一个家系仲,甚至甚至同一患者身上可以同时发生ALS和FTLD。在对大多数ALS和FTLD最常见的病理类型——泛素阳性的FTLD(FTLD-U)患者中均发现神经元中聚集物的主要成分是TAR DNA结婚蛋白-43(TAR DNA binding protein-43,TDP-43)。临床表现、病理和遗传学上的重叠,把ALS和FTLD这两种乍看毫无关联的疾病紧密联系到了一起。目前认为泛素阳性的FTLD、伴痴呆的ALS和经典的ALS组成一个疾病谱——TDP-43蛋白病,这些疾病具有共同的分子基础——TDP-43,在发病机制上可能也存在部分重叠。更出乎意料的是,随着研究的深入,发现TDP-43还与很多神经病性疾病的神经元或非神经元的包涵体形成有关,这些疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer''s disease,AD)、帕金森病,以及多聚谷氨酰胺病如Huntington病和肌炎(inclusion body myopathy,IBM)等。而且,在同一个家系中发现携带相同TARDBP突变基因的患者可分别表现为ALS和单纯的帕金森病症状;在IBM伴Paget病和FTD的患者中检测出VCP突变;在帕金森病患者中也发现了C9FOR72基因的GGGGCC核苷酸六聚体异常重复序列。越来越多的证据表明TDP-43蛋白病所包含的范围要超出我们的想象,这些神经变性疾病和ALS可能具有共同的发病机制。
遗传学的发展随即也带来了挑战。最新的研究发现,C9FOR72突变的ALS患者多数伴有神经行为功能障碍,而且绝大多数有ALS和(或)FTD的家族史,这对目前的fALS定义发出了挑战,因为这些研究的结果提示应当把具有FTD家族史的ALS患者也列为fALS。此外,由于相当部分的ALS患者存在神经行为功能障碍,这对医疗和护理也提出了新的课题,因为这部分患者对于肠道营养、无创通气等延长生命治疗的依从性和有效性下降,也不可避免地增加了护理人员的负担。
二、发病机制的研究进展和挑战
在发现SOD1后的15年里,对肌萎缩侧索硬化发病机制的研究只要集中在对SOD1的研究。针对ALS的发病机制提出了多种假说,包括遗传因素、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、轴索转运账号、线粒体功能异常、突变蛋白聚集等,但SOD1突变如何选择性地引起运动神经元损害仍不明确。近年来,随着新的ALS致病基因的发现,为ALS发病机制的研究开启了新的篇章。病理上广泛存在于大多数ALS患者神经元中的TDP-34包涵体却未见于SOD1突变的ALS患者体内,提示SOD1突变的ALS是由不同FTLD-U的ALS患者的病理机制导致的,或者只有FTLD-U的ALS患者具有共同的下游机制,越来越多的证据表明RNA加工障碍在ALS发病机制中起着关键的作用,此外,胞内体的转运障碍和蛋白质降解障碍也起着重要的作用。
TDP-43和FUS都是DNA和RNA结合蛋白,正常条件下在细胞核和细胞质间均有表达,但主要位于细胞核内,不断往返于细胞核和细胞质间,涉及RNA加工过程的众多环节,包括转录调节、选择性剪接、mRNA转运,以及microRNA的加工处理。绝大多数TARDBP基因突变位于编码与蛋白-蛋白相互作用及入核转运有关的甘氨酸富集域的第6号外显子;大多数FUS基因突变位于编码精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(RGG)富集域和核定位信号的第13~15号外显子。这些区域的突变可影响TDP-43和FUS蛋白的入核转运,导致这些蛋白聚集在细胞质内,并形成保护TDP-43盒FUS的包涵体,在各种应激条件的作用下,进一步形成应激颗粒。
TDP-43和FUS蛋白各含有2个RNS识别域,可以与其他RNA相互作用蛋白结合。在mRNA转运过程中,FUS和TDP-43都可形成mRNA转运复合体,发生突变时,由于轴突mRNA转运障碍可引起运动神经元损害;此外,这些蛋白的核内表达和功能的降低也可影响RNA加工过程的不同环节,包括前RNA剪接、核RNA输出和非编码RNA的加工。尽管TDP-43和FUS突变引起运动神经元损害的机制目前尚未完全明确,但核内TDP-43和FUS功能的缺失和(或)细胞质包涵体蛋白质聚集可能是致病的关键步骤。因此,FUS和TDP-43的致病机制,无论是通过RNA加工过程中正常核功能的缺失(功能的丧失),还是细胞质中异常蛋白的聚集产生毒性(功能的获得),或者二者兼而有之,都是合理的,但二者对于运动神经元的毒性孰轻孰重有待进一步研究。
除了FUS和TARDBP外,还有一些蛋白液参与了RNA加工过程。ANG在缺氧的条件下表达增加并促进血管生成,同事具有tRNA特异的核糖核酸酶活性,可调节核糖体RNA的转录,并可通过抑制凋亡诱导因子进入细胞核而致防止细胞死亡;ANG突变可能由于功能的缺失而致病。SETX蛋白是一种DNA-RNA解旋酶,可形成大的核糖核蛋白复合体,在应对氧化应激时维持修复RNA机制及RNA加工过程中发挥作用,因此,SETX突变的致病机制可能也涉及RNA加工过程。尽管C9ORF72基因编码产物的功能尚不明确,但研究表明C9ORF72基因非编码区的蛋白的核苷酸异常重复序列可干扰C9ORF72基因编码的蛋白的正常表达,导致转录水平下降,进而影响蛋白质的翻译;还可导致细胞核内RNA聚集,使RNA结婚蛋白含量下降,进而影响RNA加工过程。
SOD1小鼠是目前肌萎缩侧索硬化研究使用最多的模型,但SOD1小鼠的神经元中并不出现TDP-43包涵体,而TDP-43阳性包涵体鉴于绝大多数的ALS患者。因此SOD1小鼠并非完善的人类ALS模型。过去2年中,已有多个研究显示在小鼠体内过表达突变的TDP-43可以模拟出ALS和FTLD患者一些特征性的病理改变,并且出现进行性无力、痉挛性瘫痪等症状,证实TDP-43转基因小鼠可以比SOD1小鼠更好地模拟ALS患者的病理特征,是ALS很有前景的动物模型,该模型的建立无疑将极大地促进ALS发病机制的研究。
尽管对ALS发病机制的研究有了较大的进展,但仍面临挑战,距离解开ALS发病之谜还有很长一段路要走。目前对ALS发病机制的研究主要都是通过研究fALS相关的基因所得,对于绝大多数遗传病因不明的sALS,比较公认的观点是其发病是由于遗传和环境因素共同作用的结果,但对此我们却还知之甚少。在绝大多数sALS患者中发现包含TDP-43和FUS的泛素阳性包涵体,即使是未携带FUS和TARDBP突变基因的患者也是如此,高度提示TDP-43和FUS蛋白在sALS的发病机制中起着重要的作用,但TDP-43和FUS究竟是如何引起这些未携带突变基因的sALS患者的运动神经元损伤仍不清楚。今后的研究重点是明确FUS、TDP-43、C9ORF72等蛋白的正常功能,尤其在RNA加工过程各环节中所起的作用,寻找这些蛋白的疾病相关mRNA靶点,并进一步明确这些突变如何导致运动神经元的损害。此外,由于越来越多的证据表明很多的神经变性疾病可能与ALS具有相同的发病机制,病理上的共同点也提示TDP-43可能在这些神经变性病的发病机制中起了重要的作用,但TDP-43是通过何种机制引起不同患者出现各异的临床表型仍然是个迷。
三、肌萎缩侧索硬化的进展对临床的意义
1. 致病基因突变的筛查有助于疾病的诊断:由于第2代测序技术的广泛使用,目前在临床上已经能对ALS患者进行致病基因突变的筛查,这有助于对临床表型不典型的病例进行早期诊断,还可能提供一些有价值的预后信息。建议首选SOD1、TARDBP、FUS基因进行筛查,有条件的情况下,可以增加对OPTN、VCP、C9ORF72基因的筛查,对青年患者还可进行SETX和ALS2基因的筛查。但应当牢记的是携带突变基因的ALS患者只占一部分,尤其是携带突变基因的sALS患者所占的比例更低,因此,未筛查到突变基因并不能作为ALS的排除标准。
目前在临床实践中也可以对fALS家系中无症状的成员进行基因检测,但必须遵循一定的伦理学原则,欧洲神经病学学会联盟已经就此制定了详细的指南:只能检测携带已知致病突变的患者的成年的一级血缘亲属,检测必须完全自愿,并且在检测前必须给受检者提供详细的遗传咨询,在检测出致病基因突变时应当当面告知受试者,并提供相应的遗传咨询和心理辅导。此外,由于在SOD1、FUS、TARDBP、ANG、C9ORF72基因突变家系中都发现基因突变不完全显性的现象,而且由于环境因素和表观遗传因素的影响,即使同一个家系中携带相同突变基因的患者其生存期也存在较大的差异。此外,目前C9FOR72基因异常GGGGCC核苷酸六聚体重复序列树木的界值尚未明确,因而有时很难对检测出的突变做出准确的风险评估。因此,建议只对SOD1、TARDBP、FUS基因外显性高的突变携带家系提供症状前基因检测。
2.适当的生物标志物有助于判断疾病进展和预后:适当的生物标志物有助于ALS的诊断,客观评估疾病进展速度,判断预后,此外,还可以作为药物临床试验中客观的疗效判断指标。近年来出现了一些很稀有的ALS生物标志物。运动单位计数或者结合其他的神经生物参数,可以作为反映下运动神经元丧失的敏感指标,但由于无法实现方法学的标准化,在临床的应用受到一定的限制。神经影像的研究显示弥散张量成像的全脑部分各向异性可以作为衡量锥体束纤维变性进展,监测ALS疾病进展和指导预后的有价值的工具,但其临床应用价值尚需在不同的个体中进行进一步验证。脑脊液或血中磷酸化神经丝重链(pNfH)和胱蛋白酶抑制剂C(CyC)是很有前景的蛋白生物标志物。ALS患者轴突损伤后可以释放这种细胞骨架蛋白到细胞外隙并导致其在脑脊液中蓄积,因此,脑脊液中pNfH的含量升高与ALS患者轴突损伤程度相关。通过ELISA方法测定发现ALS患者脑脊液中(诊断的敏感度71%,特异度88%)和血中(诊断的敏感度58%,特异度89%)的pNfH水平明显升高,显示出了极好的临床应用价值。一项纵向研究通过每4~6个月测定1次ALS患者脑脊液中CyC含量发现,病情快速进展的患者CyC含量随时间的推移而下降,提示CyC可以作为判断预后的指标。在临床应用前,仍需要纵向的队列研究进一步评估pNfH对ALS诊断的敏感度和特异性,以及CyC对ALS患者预后判断的价值。
四、展望
尽管肌萎缩侧索硬化的发病机制尚未明确,但遗传学和分子生物学的进展已经使我们发现一些可以引起运动神经元死亡的上游机制,一些直接针对这些潜在治疗靶点的药物正在研发中,随着TDP-43小鼠模型等新的肌萎缩侧索硬化动物模型的建立,以及特异的疾病生物标志物的出现,必将加快新药要发的进程,离肌萎缩侧索硬化特效治疗药物诞生的那一天也越来越近了。(参考文献:邹漳钰 李晓光 崔丽英 《肌萎缩侧索硬化研究进展及面临的挑战》 中华神经科杂志2012年12月第45卷第12期)