克白灵苏孜阿甫片主要由芸香草、紫草、苦艾3味药材组成,经一定的制剂工艺提取后加适量赋形剂研制而成,临床用于动脉硬化、冠心病、肝脏疾病等的治疗。由于这3种药材中均含没食子酸,而没食子酸的药理作用与克白灵苏孜阿甫片的临床应用相关,故选择没食子酸做为含量测定指标,测定其中没食子酸的含量。在实验中建立的高效液相测定法具有简便、快速、准确、重复性高等特点,可用于该制剂的质量控制。
1仪器与试药
Shimadz全自动液相色谱仪(紫外检测器,LC-2010C系统控制器);Shimadzu CLASS-VP V6.14 SPl数据工作站。
没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110831-200302),克白灵苏孜阿甫片3批样品;甲醇为色谱纯,四氢呋喃和磷酸为分析纯,水为重蒸馏水。
2方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱(YMC-Pack ODS-A,6.0mm×150 lnln,5um);流动相甲醇-四氢呋喃-磷酸-水(0.5:0.2:0.5:99);流速0.7 mL•min-1;检测波长270 nm;柱温35℃;进样量10uL。
2.2溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品适量,加流动相溶解成每1 mL含没食子酸0.208 mg的溶液,作为对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备 取本品20片,除去包衣,取5 g,精密称定,置100 mL圆底烧瓶中,加2%冰醋酸甲醇溶液50 mL,水浴回流3 h,抽滤,残渣用适量甲醇冲洗,滤液挥于,残渣加流动相,超声10min溶解并转移至25 mL量瓶中,用流动相定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性样品溶液的制备 取处方中缺药材的辅料,依供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
2.3系统适用性实验 依“2.2.2”项下方法进行系统适用性实验,结果没食子酸理论塔板数为7340,分离度为2.1,拖尾因子为1.02,均符合药典规定。
2.4专属性实验依“2.2”项下方法进行制备样品溶液,依法进行测定,记录色谱图。图谱显示阴性无干扰,见图1(略)。
2.5线性关系考察 分别精密量取没食子酸对照品贮备溶液(0.208 mg•mL-1)0.5,1.0,2.0,3.0,4.0 mL置于10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,即得系列标准溶液,依测定法进行测定。以对照品浓度为横坐标,蜂面积为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为:Y=5E+07X-26925,相关系数r=0.9998(n=5)。结果表明,没食子酸在10.4~83.2ug•mL-1,峰面积与浓度呈良好的线性关系。
2.6检测限和定量限的考察 取没食子酸对照品溶液,用流动相依次稀释制成一系列溶液,按信噪比(S/N)为3测得没食子酸检测限为80.3 ng•mL-1;按信噪比(S/N)为l0测得没食子酸定量限为250.9ng•mL-1。
2.7精密度实验 取同一供试品溶液,依测定法连流动相时续进样6次,记录峰面积,结果没食子酸峰面积RSD0.15%。
2.8重复性实验取同一批样品,平行制备6份,依测定法进行测定,结果没食子酸含量RSD 0.89%。
2.9供试品溶液稳定性实验取供试品溶液在0,2,4,6,8,12,24 h分别进样测定没食子酸含量,考察其24 h内稳定性。结果没食子酸含量RSD 1.9%,其峰形和含量变化不大,表明溶液在24 h稳定。
2.10加样回收率实验 精密称取已知含量的供试品2.5 g,精密称定,共9份,3份为1组,分别加入一定量的没食子酸对照品溶液,依法进行测定,结果见表1。(略)
2.11 3批供试品含量测定取3批样品,依法进行含量测定,结果克白灵苏孜阿甫片中没食子酸的质量分数分别为90.5,89.5,88.3ug/片。
3讨论
本实验考察了甲醇-四氢呋喃-冰乙酸-水(0.1:0.5:2:97.4)为流动相时,出峰时间较快,分离度也不好;甲醇-四氢呋喃-0.2%磷酸(0.5:0.5:99)为流动相时,峰较宽。当采用甲醇-四氢呋喃-磷酸-水(0.5:0.2:0.5:99)时没食子酸与其相邻峰的分离度较好,无拖尾现象,且无其它峰干扰,操作简便实用。
实验过程中考察了样品的不同处理方法,采用盐酸回流处理时供试品溶液的黏度过大,无法准确定容,没食子酸含量偏低,且峰形不好,分离效果差。用甲醇超声处理样品时,峰形较好,但分离效果差,含量较前方法有所提高。用2%冰醋酸甲醇超声处理样品时峰形及分离效果都较好,但供试品溶液颜色过深,色素含量高,时间长会污染堵塞预柱筛板,并使柱子压力升高,且重复性不好,含量差异大。当采用2%冰醋酸甲醇回流处理3 h,残渣超声处理10min后的供试品溶液峰形及分离效果较好,含量较高而颜色较浅。
本文采用RP-HPLC法测定了克白灵苏孜阿甫片中没食子酸的含量,处理方法便捷,测定结果准确可靠,可以作为克白灵苏孜阿甫片生产过程的质量控制指标。