异基因造血干细胞移植免疫治疗进展

    １９６８年中国人民解放军第七军医大学本科毕业，１９８２北京医科大学研究生毕业。１９８４和１９８９年先后在澳大利亚新南威尔士州立大学圣．文森特医院和法国巴黎居里大学圣．安托万医学院客座研修。现任中华血液学会、中国实验血液学会常务委员，全军血液学专业委员会主任委员等。兼任《中华血液学杂志》、《解放军医学杂志》、《中国实验血液学杂志》、《临床血液学杂志》、等７本杂志的副主编或编委。在国内外权威性医学刊物上发表论文２２０余篇，主编医学专著４部。获国家级、全军及省级科学技术进步奖２０余项。亨受政府特殊津贴。

    异基因造血干细胞移植�煟龋樱茫裕牭哪康氖墙�立供者型的正常造血与免疫功能，以取代受者原有的异常的造血及免疫系统。其治疗恶性肿瘤的主要机制系利用正常供者的免疫系统识别和攻击突变的肿瘤细胞（移植物抗瘤效应，ＧＶＴ）从而达到治愈目的。由于供受者间的免疫差异，即使ＨＬＡ完全相合的移植，也难完全避免移植后的相互排斥，即发生移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）或移植排斥（ＨＶＧ）。由此可见，成功的异基因造血干细胞移植的全过程，从供者干细胞的植入、充分发挥ＧＶＴ效应、防治ＧＶＨＤ和ＨＶＧ，到受者造血、免疫功能的重建、肿瘤的完全治愈并保持健康的生活质量，主要技术皆与免疫学密切相关。本文将就异基因造血干细胞移植免疫治疗方面的进展作简要介绍。

    １．Ｔ细胞与移植

    过去十年中，由于支持治疗，特别是先期的预防性抗感染治疗、生长因子的应用及外周血造血干细胞的采用已使ＨＳＣＴ的疗效取得突破性进展，移植相关并发症及病死率已大幅降低。防治ＧＶＨＤ的免疫抑制剂包括各类化疗药物、抗淋巴细胞球蛋白,抗ＴＮＦ、ＣＤ52、ＣＤ25单抗等。尽管如此，ＧＶＨＤ仍是ＨＳＣＴ最棘手的并发症，激素是目前最有效的治疗药物。ＧＶＨＤ危及生命，但是采用各种免疫抑制防治的同时势必导致感染等各类严重的并发症及肿瘤的复发，因此目前的焦点问题是如何在防治ＧＶＨＤ的同时避免免疫抑制所造成的各种并发症。２０多年前开始采用的去Ｔ细胞移植尽管使ＧＶＨＤ得到控制，但移植排斥、复发、因免疫重建延迟带来的严重感染等问题随之而来，更重要的是在ＨＳＣＴ治疗中最为关键的ＧＶＴ效应大打折扣，去Ｔ细胞移植后的无病生存（ＤＦＳ）与非去Ｔ细胞移植相比并无显著区别。临床资料表明，ＧＶＨＤ与ＧＶＴ的关系错综复杂：ＧＶＨＤ的出现有助于降低肿瘤的复发率，但在无ＧＶＨＤ发生的情况下进行供者淋巴细胞输注（ＤＬＩ）也可使白血病得到治愈，这一结果支持动物及体外实验中的发现，即ＧＶＨＤ和ＧＶＴ效应两者的确是可分离的。目前的问题是：在临床移植中如何找到有效可行的办法，从而在防止ＧＶＨＤ的同时发现ＧＶＨＤ和其他免疫反应的区别，以保留ＧＶＴ效应和机体针对感染的免疫应答。

    随着对Ｔ细胞免疫反应和该过程中Ｔ细胞分化、成熟的深入了解，对异体移植物进行适当的处理、对其中不同的免疫反应细胞进行调控，已使加强ＧＶＴ及抗感染效应、减轻或避免ＧＶＨＤ的发生成为可能。

     １．１ 通过选择性去Ｔ细胞分离ＧＶＨＤ和ＧＶＴ效应

    对异源反应性Ｔ细胞进行清除、转移或诱导无反应性，如ＣＤ40配体的抗体可阻断宿主抗原提呈细胞�煟粒校茫牭牡诙�信号，抗Ｔ细胞活化的抗体（ＣＤ69、ＣＤ25、Ｆａｓ）通过中和免疫毒素或诱导凋亡而杀伤Ｔ细胞，免疫磁珠或流式分选转移已活化的Ｔ细胞等。新近采用的光动力学方法利用对光敏感的若丹明染料ＴＨ９０４２来清除Ｔ细胞，在可见光的作用下，药物发出放射活性从而选择性地杀伤活化的Ｔ细胞。

    Ｍｉｃｈａｌｅｘ等的实验研究成功地找到了引起ＧＶＴ效应和ＧＶＨＤ反应的Ｔ细胞确实来源不同的分子学证据，他们以病人的白血病或淋巴细胞刺激供者Ｔ细胞并通过ＴＣＲ序列确认了白血病特异性克隆，ＧＶＴ效应可被肿瘤特异性抗原（不引起ＧＶＨＤ）介导。因此选择性地去除非肿瘤细胞的抗原特异性Ｔ细胞，而不伤及肿瘤抗原特异性Ｔ细胞，便可达到分离ＧＶＨＤ和ＧＶＴ的目的。在移植模型中，现已能成功地去除宿主抗原在体外激活的Ｔ细胞而并不损伤抗白血病效应。采用前述光动力方法，发现当带有染料的细胞被光照后，对宿主正常组织具有特异性的杀伤性Ｔ细胞显著减少，但肿瘤特异性Ｔ细胞及除此两者之外的第三类Ｔ细胞的大部分仍保留。选择性地去除Ｔ细胞或诱导Ｔ细胞无反应的临床试验已在开展，在半相合移植治疗儿童非肿瘤性疾病的临床研究中，以蓖麻毒素－Ａ链免疫毒素选择性地去除ＣＤ２５，初步的结果显示ＧＶＨＤ的发生率明显降低，并且虽然仅输入了小剂量的Ｔ细胞，免疫重建也明显优于非选择性去Ｔ细胞的移植。来自美国ＮＩＨ的非清髓性ＨＬＡ相合同胞移植研究，同样应用上述免疫毒素选择性去除１×１０８／ｋｇ的ＣＤ３＋细胞，供者的反应细胞被置于宿主髓系细胞或Ｂ细胞的环境中，以使对系性限制性白血病或非白血病抗原发生反应的Ｔ细胞得以保留，结果显示供者细胞完全植入，ＧＶＨＤ减轻。

    １．２ 转移童贞（ｎａ�啠觯澹�Ｔ细胞

    在小鼠试验中，童贞Ｔ细胞从未接触过抗原，表达ＣＤ62Ｌ，而接触过抗原的记忆或活化Ｔ细胞可能是ＣＤ62Ｌ+或ＣＤ62Ｌ-细胞。假设供者Ｔ细胞从未接触过宿主抗原，那么ＧＶＨＤ中被诱导的Ｔ细胞将是童贞Ｔ细胞，记忆／活化Ｔ细胞将不能诱导ＧＶＨＤ。混合淋巴细胞培养�煟停蹋遥犗允疽焯逑赴�的增殖潜力在童贞细胞（ＣＤ62Ｌ+）群中更为突出，在移植模型中，分别将ＣＤ62Ｌ+和ＣＤ62Ｌ-输入体内�熗�贞Ｔ表型的细胞可引起ＧＶＨＤ�煻�记忆Ｔ细胞无此效应。

    １．３ 筛选Ｔｈ２／Ｔｃ２细胞

    目前已确认的功能性Ｔ细胞有：ＣＤ4+辅助性Ｔ细胞（Ｔｈ１或Ｔｈ２亚群）、ＣＤ8+杀伤性Ｔ细胞（Ｔｃ１或Ｔｃ２亚群）。Ｔｈ１和Ｔｃ１分泌ＩＬ－２和ＩＦＮ－γ，Ｔｈ２和Ｔｃ２分泌ＩＬ－４、ＩＬ－５和ＩＬ－１０。在动物实验中，供者Ｔｈ２细胞不启动ＧＶＨＤ，但可介导ＧＶＴ效应，且Ｔｃ２细胞发挥了强力的否决（Ｖｅｔｏ）效应而避免移植排斥�熞虼松秆。裕瑁埠停裕悖蚕赴�可促进植入，启动ＧＶＴ效应而避免ＧＶＨＤ。上述动物实验的成功，促进了在非清髓性移植中输注Ｔｈ２／Ｔｃ２细胞治疗血液系统恶性肿瘤的临床试验的开展。

    １．４应用辅助性Ｔ细胞

    辅助性Ｔ细胞为ＣＤ4、ＣＤ25阳性细胞，对诱导和维持自身耐受非常重要。动物实验中去除这种细胞会导致自身免疫或加剧ＧＶＨＤ；输注这类细胞，在自身免疫模型中可消除自身免疫，在移植模型中则可抑制ＧＶＨＤ。这一结果提示ＣＤ4+、ＣＤ25+辅助性Ｔ细胞具有强大的免疫调节作用，但同时动物实验中也显示去除这些细胞会促进肿瘤特异性免疫应答从而清除肿瘤，因此该类细胞的应用是否会消弱ＧＶＴ尚需进一步的临床研究来证实。

    ２．ＮＫ细胞与移植

    Ｔ细胞异基因免疫应答需要激活和扩增，ＮＫ细胞则通过与其他细胞间的相互作用产生一个阳性信号，而后通过释放穿孔素、颗粒酶直接杀伤靶细胞。研究发现Ｔ细胞是ＧＶＨＤ的主要效应细胞，而ＮＫ细胞则是ＧＶＴ及ＨＬＡ不相合移植成功植入的主要效应细胞。

    ２．１ ＮＫ细胞的活化与抑制

    ＮＫ细胞表达ＣＤ25、ＣＤ16，不表达ＣＤ3，通过细胞毒性作用和分泌细胞因子如ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及ＧＭ－ＣＳＦ等发挥效应。ＮＫ细胞对于移植的重要性源于其对ＭＨＣ－Ｉ类抗原的识别。人类ＮＫ细胞至少表达四种活化型受体及两种抑制性受体。ＮＫ细胞对ＭＨＣ－Ｉ类分子的特异性识别是通过含有免疫受体酪氨酸活化性基序（ＩＴＡＭ）的杀伤细胞免疫球蛋白超家族受体（ＫＩＲ）和ＣＤ９４家族的Ｃ型凝集素受体来实现。ＮＫＧ２Ｄ是ＮＫ细胞活化型受体，可识别ＭＨＣ－Ｉ类分子，其他活化型受体可识别一些尚未明确的配体。含有免疫受体酪氨酸抑制性基序（ＩＴＩＭ）的ＫＩＲ和ＣＤ94家族的其他Ｃ型凝集素可抑制ＮＫ细胞的活化。编码活化及抑制型ＫＩＲ的基因位于１９号染色体，Ｃ型凝集素受体基因位于１２号染色体。细胞表面受体介导活化和抑制信号的平衡从而调整ＮＫ细胞的功能，如图所示为ＮＫ细胞的活化与抑制模式�熣�常细胞表达的ＭＨＣ－Ｉ类分子与ＮＫ细胞上的杀伤抑制型受体连接，活化信号被抑制使ＮＫ细胞不产生使靶细胞溶解的溶细胞活性。缺少ＭＨＣ－Ｉ类分子表达的异常细胞，活化信号因不能被杀伤抑制性受体传递的抑制信号阻断，故被ＮＫ细胞溶解。

    正常情况下，ＮＫ细胞表面的ＫＩＲ识别靶细胞的ＭＨＣ－Ｉ类分子配体，如ＨＬＡ－Ｃ和ＨＬＡ－Ｂｗ４等。由于ＮＫ细胞至少表达自身ＭＨＣ－Ｉ类分子的一个抑制受体，ＫＩＲ与自身细胞的ＭＨＣ配体结合从而发出杀伤抑制信号，阻止ＮＫ细胞对正常组织的非特异性杀伤作用，从而对自身正常组织产生保护作用。当ＮＫ细胞不能识别自身ＭＨＣ－Ｉ类分子时，杀伤的抑制信号不能传递，ＮＫ细胞即释放穿孔素／颗粒酶直接杀伤靶细胞，随即产生一系列临床免疫损伤。

    ２．２ ＮＫ细胞的异源反应活性

    多数人表达较完全的ＫＩＲ抑制性受体基因，可识别３组主要ＨＬＡ－Ｉ类配体（第１组ＨＬＡ－Ｃ，第２组ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－Ｂｗ４）。对１６２例个体进行分析，９７％的ＫＩＲ表达ＫＩＲ２ＤＬ基因，是第１组ＨＬＡ－Ｃ抗原决定簇的受体；１００％ＫＩＲ表达ＫＩＲ２ＤＬ２／３，为第２组ＨＬＡ－Ｃ抗原决定簇的受体；９４％表达ＫＩＲ３ＤＬ１，是ＨＬＡ－Ｂｗ４抗原决定簇的受体。ＫＩＲ独特型不相合移植中，当异体靶细胞不表达Ｉ类等位基因时便不能阻断ＫＩＲ，ＮＫ细胞即可发挥其溶细胞活性。

    半相合移植中，由ＮＫ细胞介导的溶细胞活性由供者ＮＫ细胞的ＫＩＲ独特型与受者ＨＬＡ－Ｉ类分子的不相合所触发。这一作用目前被称为供者抗受者的ＮＫ细胞异源反应活性。在动物模型中，ＮＫ细胞强有力地攻击宿主的造血细胞，而对通常Ｔ细胞在ＧＶＨＤ中针对的靶组织则不具有杀伤作用。将人的异源反应活性ＮＫ细胞（ＫＩＲ独特型不相合）输入已植入人ＡＭＬ细胞的ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠�熢诙哉兆椋�小鼠３周后死亡，而在治疗组，少量的人异源反应活性ＮＫ细胞即可清除白血病细胞，使小鼠得以存活。在子代Ｆ１ Ｈ２ｄ／ｂ小鼠（供鼠）与亲代Ｈ－２ｂ小鼠（受鼠）的移植中，供者的ＮＫ细胞不表达Ｈ－２ｂ特异性的Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ受体，而表达Ｈ－２ｄ特异性的Ｌｙ４９Ａ／Ｇ２受体，因此供者ＮＫ细胞可杀灭宿主的靶细胞。研究还发现，即使输入大剂量的异源反应活性ＮＫ细胞给经过致死性放疗处理过的受者也并不导致ＧＶＨＤ。在非致死性放疗处理过的受者中，异源反应活性ＮＫ细胞可将骨髓和脾中的受者Ｔ细胞和中性粒细胞数降低至低于经致死性预处理的受者的水平。单独接受非致死性ＴＢＩ（小于７Ｇｙ）预处理的小鼠对供者的骨髓移植物发生排斥，但同时接受异源反应活性ＮＫ细胞输注的小鼠，其体内则持续出现了供者型造血细胞。２×１０５个供者异源反应活性ＮＫ细胞即可导致受者体内出现供者型造血，而非异源反应活性ＮＫ细胞则不具备该效应。异源反应活性ＮＫ细胞甚至可以在非清髓性ＨＳＣＴ中发挥作用，经过非清髓性预处理的小鼠同时接受低剂量的异源反应活性ＮＫ细胞输注，可检测到大于８０％的供者型嵌合；即使给予仅包括氟达拉宾的强度较低的预处理，也可达到３０％以上的供者型嵌合。在移植后６周输入供者的异源反应活性ＮＫ细胞，可将混合型嵌合体转变为１００％供者型嵌合。研究推测ＮＫ细胞使宿主免于ＧＶＨＤ损伤的保护机制在于异源反应活性ＮＫ细胞能攻击受者的ＡＰＣ细胞，而后者为启动ＧＶＨＤ所必需。

    ２．３ ＮＫ细胞在植入、ＧＶＨＤ及ＧＶＴ中的作用（见图２）

    综上所述，与Ｔ细胞的异源反应活性不同，ＮＫ细胞的异源反应活性因其下述特性非常适用于移植：①通过杀伤宿主的淋巴系造血细胞而促进植入。在ＨＬＡ不相合移植中，供者ＮＫ细胞可产生移植物异源反应活性，从而通过识别和杀伤受者残留的淋巴系细胞有力地促进植入。②异源反应活性ＮＫ细胞可杀灭白血病细胞，从而发挥ＧＶＴ效应。ＮＫ细胞遇到ＫＩＲ独特型不相合的肿瘤细胞时，即表现出强大的细胞毒作用，这是ＨＬＡ相合移植和自体移植不能比拟的。ＮＫ细胞不相合的优势已在ＡＭＬ患者半相合或无关供者去Ｔ移植后复发率显著降低中得到证实，但迄今为止�熣庖挥攀平鼍窒抻谒栊园籽�病和去Ｔ细胞移植。③ ＮＫ细胞强力攻击宿主的造血细胞，而对ＧＶＨＤ攻击的靶组织则不具有杀伤作用，因此并不诱导ＧＶＨＤ，进一步能通过杀伤宿主ＤＣ�熓魍蛔聪赴��牰�抑制Ｔ细胞介导的ＧＶＨＤ。

    ２．４ 异源反应性ＮＫ细胞在ＨＳＣＴ中的应用

    实验证明，输入具异源反应活性的ＮＫ细胞与ＡＭＬ移植后复发率降低直接相关。体外研究显示，异源反应活性ＮＫ细胞具有显著的ＧＶＴ效应，可１００％杀灭白血病细胞，但只有少部分表达淋系标记的急性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞被溶解，这是迄今为止在原发肿瘤中对ＮＫ异源反应活性唯一不敏感的肿瘤细胞。

    动物实验的成功已使一些研究小组选择性地开展ＮＫ细胞不相合的无关供者移植或半相合移植，并由此设想输注来自供受者之外的第三者的异源反应性ＮＫ细胞来增强ＧＶＴ效应、防止ＧＶＨＤ。Ｒｕｇｇｅｒｉ等在５７例高危ＡＭＬ移植中输注异源反应活性ＮＫ细胞，结果白血病的复发率显著降低，同时也避免了ＧＶＨＤ。Ｖｅｌａｒｄｉ等对１９９３～２００３年间的８５例晚期ＡＭＬ（ＣＲ２≥８０％）半相合移植进行了分析，结果显示输注供者不相合ＮＫ细胞促进了植入而未加剧ＧＶＨＤ，更有意义的是白血病的复发得到了有效控制。在无ＮＫ细胞异源反应活性的４４例移植中（２１例为ＣＲ，２３例为复发病例），移植后的复发率为７９％，无事件生存率（ＥＦＳ）为７％；而在３６例（２３例为ＣＲ，１３例为复发病例）输入ＮＫ异源反应活性细胞的移植中，移植后的复发率为１７％，ＥＦＳ为５２％，由此得出结论，无ＮＫ细胞异源反应活性的供者是预测移植复发的独立因素。

    ＫＩＲ独特型可由ＰＣＲ法确认，３％的人群不表达ＫＩＲ２ＤＬＩ，６％不表达ＫＩＲ３ＤＬ１，ＫＩＲ２ＤＬ２／３则１００％表达，识别ＫＩＲ基因型有助于最终确定具有异源反应活性ＮＫ细胞的供者。对此类供者的选择已由目前从父母兄弟姐妹的直系亲属范围扩展至姨表、叔表等亲系中。第１组、第２组ＨＬＡ－Ｃ及ＨＬＡ－Ｂｗ４抗原决定簇均表达者，找不到ＮＫ细胞不相合的供者，而仅有三者之一或三者之二表达者则有机会找到。

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