他克莫司(tacrolimus,简称F~06)是日本藤泽公司1984年从链霉菌属培养物中分离得到的大环内酯类新型免疫抑制剂,现已能全合成。主要药理作用是能有效抑制T淋巴细胞激活,与内源性细胞受体结合,形成一个亲免素复合物,从而发挥药理作用。与环孢素A(CsA)相比,体内外试验证实他克莫司的免疫活性为CsA的50~100倍 临床可有效预防器官移植后急性排斥反应,逆转难治性排斥。CsA治疗无效者,65%一80%的患者可使用本品治疗。目前他克莫司已在肝、肾、心、胰等器官移植中广泛用于抗排斥及自身免疫系统相关疾病的治疗Ⅲ。本文通过比较国产和进口他克莫司胶囊在健康人体的药代动力学参数,评价两种制剂的生物等效性。
本试验中采用的LC—MS/MS法测定受试者体内他克莫司血药浓度。研究发现,他克莫司在ESI源正离子方式下信号较高,本研究选用M+H1作为MRM扫描方式的母离子,二级碎片扫描时较高的特征碎片有m/z 768.5和m/z 786.5,选用信号较高的碎片离子ndz 768.5作为子离子进行定量,选用ndz 786.5进行定性考察或同步考察。流动相中加入乙酸铵可以提高质谱离子化效率.从而提高信噪比。由于本试验定量限和检测限较低.研究初期进行等度洗脱时很难达到目标定量限,为了提高信噪比,使用梯度是较为理想的选择。本研究所选用的色谱柱孔径和内径均较大,可以达到较高的流速.在此条件下采用梯度方式进行梯度洗脱,可以得到较好的色谱峰,降低梯度延迟效应,缩短分析时间。在梯度洗脱条件下,内标的选择相对来说比较容易,内标选用本研究室现有的对照品曲马多、地西泮等进行考察。试验最初选用曲马多进行试验。峰型和保留时间均较满意,但经过长时间进样后发现内标曲马多在试验梯度条件下有柱上累积效应。后改用地西泮,结果较好。
常见的样品前处理方案有液一液萃取法、固相萃取法和沉淀蛋白法等,固相萃取法成本较高,液一液萃取法比沉淀蛋白处理繁琐。本实验在不影响灵敏度的前提下,采用了极其简便的沉淀方法,节省了大量的前处理时间,提高了工作效率。对于他克莫司全血样品而言最为关注的是稳定性问题,试验中进行了多种稳定性考察。发现全血样品在冷冻和冷藏条件下均较为稳定。但他克莫司在纯水或甲醇环境中易发生结构转化,因些,试验过程中应尽量避免此类情况。全血样品沉淀蛋白的方法可能会比较脏,试验中最好将色谱溶剂前沿切入废液罐,以免造成质谱仪的污染。