摘要 目的:观察七十味珍珠丸抗实验性大鼠脑血栓形成的作用,并初步探讨其作用机制。方法: 用结扎颈外动脉同时颈内动脉注射复合血栓诱导剂的方法建立实验性脑血栓形成大鼠模型。以阿司匹林作为阳性对照组,观察七十味珍珠丸对实验性脑血栓大鼠脑梗塞区伊文思蓝含量、脑水肿程度、血液流变学指标及血浆中血栓素A2( thromboxane A2,TXA2 ) 、前列环素( prostacyclin,PGI2 ) 水平的影响。结果:与模型组相比,七十味珍珠丸高剂量( 300 mg /kg) 、中剂量( 150 mg /kg) 、低剂量( 75 mg /kg) 都不同程度的减轻了实验性模型大鼠脑血栓程度、脑水肿程度;降低了全血低切粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数; 同时抑制了模型大鼠血浆中TXA2 和PGI2 这对活性物质的失衡。结论:七十味珍珠丸可抑制血栓诱导剂诱导的脑血栓形成; 其机制可能与下调血液流变学指标和改善TXA2 /PGI2 系统失衡有关。
关键词 七十味珍珠丸; 脑血栓形成; 脑水肿; 血液流变学; 血栓素A2( TXA2) ; 前列环素( PGI2)
七十味珍珠丸( Rannasangpei) 是最有代表性的、应用最广、疗效显着的藏成药之一,主要由佐太、天然珍珠、天然牛黄、羚羊角、麝香、藏红花、檀香、安息香、降香、九眼石、玛瑙、珊瑚等70 余味名贵藏药组成[1],具有通经活络,调和气血,安神、镇静,醒脑开窍之功效。而目前研究七十味珍珠丸抗脑血栓的文献甚少。因此,本实验通过检测实验性脑血栓大鼠脑梗塞区伊文思蓝含量和脑水肿程度来观察七十味珍珠丸抗脑血栓作用,同时,通过测定实验性脑血栓大鼠血液流变学各指标和血栓素A2( TXA2) 、前列环素( PGI2) 水平来探讨其抗脑血栓的机制。
1 材料与方法
1. 1 实验药品七十味珍珠丸由北京藏医院提供,批号:
20120809。阿司匹林肠溶片由亚宝药业太原制药有限公司提供,批号: 20120802。
1. 2 动物SPF 级SD 大鼠96 只,体重250 ~ 300g,雌雄各半,由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号: SCXK 粤2011-0015( NO: 44002100000736) 。
1. 3 试剂盐酸肾上腺素注射液( Adrenaline HydrochlorideInjection ) 为上海禾丰制药有限公司生产; 5 '-二磷酸腺苷( 5 '-ADP-Na2) 、凝血酶( Thrombin) 、伊文思兰( Evens blue) 、硫酸钠( Na2SO4) 分析纯、丙酮分析纯、血栓素B2( TXB2) ELISA 试剂盒、6-酮-前列腺素F1α( 6-keto-PGF1α) ELISA 试剂盒均购自广州拓科达生物科技有限公司。
1. 4 仪器2K-15 低温离心机由南方医科大学生命科学楼解剖教研室提供。血液流变分析仪由南方医院检验科提供。
1. 5 方法250 ~ 300g 大鼠96 只,分为两批,每批随机分为6组,即空白组、模型组、七十味高剂量组( 300 mg /kg) 、七十味中剂量组( 150 mg /kg) 、七十味低剂量组( 75 mg /kg) 、阿司匹林组( 8. 24 mg /kg) ,每组各8 只大鼠。每天灌胃给药1 次( 按体表面积法) ,连续14 天,于造模前1h 给药1 次,给药剂量及途径同前,空白组和模型组用蒸馏水灌胃。第一批: 进行脑血栓程度( 脑梗塞区每克脑组织中伊文思蓝含量) 和脑水肿程度的检测;第二批: 进行血液流变学、血栓烷B2( thromboxane B2,TXB2) 及6-酮-前列腺素F1α( 6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α) 水平的检测。
末次给药1h 后,进行脑血栓形成实验,实验时腹腔注射10%水合氯醛( 0. 35g /kg) 麻醉,左颈总动脉、左侧颈外动脉,穿线备用,先结扎左侧颈外动脉,然后结扎左颈总动脉近心端,用大鼠动脉夹在距远心端离结扎处约1cm 的地方夹闭以便再通,在左颈总动脉结扎处与夹闭处之间剪一小口,以直角针头从小口向头部方向进针注射复合血栓诱导剂,注射时打开动脉夹使血管再通,注射完毕再夹闭[2]。除空白组外,其余各组由左颈总动脉剪口处注入复合血栓诱导剂( 二磷酸腺苷1. 25mmol /L: 凝血酶1. 25 万u /L: 肾上腺素1g /L = 100: 200: 5) 100g 体重0.1ml,空白组注入等量生理盐水。
1. 5. 1 脑血栓程度、脑水肿程度检测第一批大鼠注入复合血栓诱导剂10min 后,注入0. 2%伊文思蓝100g 体重0. 5ml,再过5min 后迅速断头,冰中取脑,用生理盐水洗去残血,滤纸吸干,分析天平称重后,剪成碎片,置于电动匀浆器中,加入0. 5%Na2 SO4: 丙酮= 3: 7,制成匀浆液( 5ml /每克脑) ,将匀浆液倒入加盖试管中,4℃ 密封放置6h,4000rpm 离心10min,取上清液3ml 移入试管,然后再以5000rpm 离心10min,取上清液,以生理盐水调零,用可见分光光度计在620nm 处以1cm 光径比色,测定吸光度( A) 值,以栓塞半球( 左侧为梗塞区,右侧为对照区)的光密度A 与其脑重量之比( A/左脑湿重) 表示伊文思蓝的含量,以此表示脑血栓的严重程度。以梗塞区半球( 左侧) 重量与对照右半球重量的比值( 左/右脑湿重) 表示梗塞侧脑水肿的程度[3]。
1. 5. 2 血液流变学指标检测第二批大鼠注入复合血栓诱导剂后用缝线结扎针眼,缝合皮肤,单笼饲养。造模24h 后,经腹腔注射麻醉大鼠,使用一次性负压柠檬酸钠( 1: 9) 采血管从腹主动脉采血6ml,其中5ml 血样送南方医院检验科测血液流变学各项指标: 全血粘度低切( BGH 10s-1) 、全血粘度中切( BGH60 s-1) 、全血粘度高切( BGH 150 s-1) 、血浆粘度( PGLUT) 、红细胞聚集指数( RBCJJZS) 。
1. 5. 3 血浆中TXB2、6-keto-PGF1α 及TXB2 /6-keto-PGF1α 水平测定上述剩余1ml 血样3000 rpm 4℃ 离心20min,取血浆分装,-20℃保存,按ELISA 试剂盒说明书测定TXB2及6-keto-PGF1α 水平。
2 结果
2. 1 七十味珍珠丸对实验性脑血栓大鼠脑梗塞区伊文思蓝含量的影响脑血栓模型制造后,肉眼可明显看出左侧脑半球蓝染,右半球看不出蓝染,说明左侧半球血栓模型制造成功[3]。
与空白组比较,模型组A/左脑湿重明显升高; 与模型组比较,七十味高剂量组( 300 mg /kg) 、中剂量组( 150 mg /kg) 、低剂量组( 75 mg /kg) 和阿司匹林组( 8. 24 mg /kg) 都不同程度的降低了A/左脑的比值; 而七十味高、中、低剂量组与阿司匹林组比较均无统计学差异,见表1。
2. 2 七十味珍珠丸对实验性脑血栓大鼠左右半球湿重的影响与空白组比较,模型组左/右脑湿重明显升高; 与模型组比较,七十味高剂量组( 300 mg /kg) 、中剂量组( 150 mg /kg) 、低剂量组( 75 mg /kg) 、阿司匹林组( 8. 24 mg /kg) 都不同程度的降低了左、右脑湿重比值; 而七十味各组与阿司匹林组比较均无统计学差异。
2. 3 七十味珍珠丸对实验性脑血栓大鼠血液流变学各指标的影响与空白组比较,模型组大鼠全血粘度低切( BGH 10 s-1 ) 、中切( BGH 60 s-1 ) 、高切( BGH 150 s-1 ) 、血浆粘度( PGLUT) 、红细胞聚集指数( RBCJJZS) 都明显升高。与模型组比较,七十味高剂量组( 300 mg /kg) 、中剂量组( 150 mg /kg) 、低剂量组( 75mg /kg) 和阿司匹林组( 8. 24 mg /kg) 都不同程度的降低了全血粘度( 低切) 、血浆粘度、红细胞聚集指数; 中切和高切无差异。
2. 4 七十味珍珠丸对实验性脑血栓大鼠血浆中TXB2、6-keto-PGF1α 水平及TXB2 /6-keto-PGF1α 比值的影响与空白组比较,模型组大鼠血浆中TXB2、6-keto-PGF1α 的含量明显升高,TXB2 /6-keto-PGF1α 比例也明显升高; 与模型组比较,七十味珍珠丸各剂量和阿司匹林都不同程度降低了大鼠血浆中TXB2、6-keto-PGF1α 的含量,并明显降低了异常升高的TXB2 /6-keto-PGF1α 比例; 以上三项指标,七十味高剂量组与阿司匹林组相比均无统计学差异。而七十味中、低剂量组和阿司匹林组大鼠血浆中6-keto-PGF1α 的含量无差异。
3 讨论在临床病理过程中,脑血栓是受多种因素作用经多种途径而诱发形成的,血管内皮损伤与血管收缩、血小板聚集与释放、纤维蛋白凝固等参与这一过程,因此,单纯以一种致栓剂不能真正全面的模拟脑血栓形成的病理。已知二磷酸腺苷( adenosinediphosphate,ADP) 可通过结合血小板膜受体,抑制腺苷酸环化酶,引起细胞内Ca2 + 浓度升高,激活血小板,提高血小板磷脂酶A2 活性,促进血小板内花生四烯酸代谢,增加TXA2 的生成与活性,诱导血小板聚集[4]。凝血酶可使血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白促使血液凝固[5]。而肾上腺素能促进血管收缩,因此,本实验选用二磷酸腺苷、凝血酶和肾上腺素配成复合血栓诱导剂,通过颈内动脉注射法建立脑血栓模型,这种造模方法能更好地模拟血栓形成的病理过程和实际情况。
伊文思蓝( EB) 是一种偶氮基荧光染料,它具有能在体内外与血清白蛋白结合的特性[6]。正常情况下EB 进入体内后与血清白蛋白结合不能通过血脑屏障( BBB) ,只有在病理情况下影响了脑血管的通透性时,伊文思蓝就会通过血管壁进入脑组织,因此,通过测定每克血栓侧脑组织中伊文思蓝的含量( A 值) 可以评价脑血管的通透性,从而衡量脑血栓的严重程度。此外,由于脑血栓形成后脑血管通透性的升高,导致组织间隙水肿,形成脑水肿,本实验利用左/右脑湿重来评定血栓侧脑水肿的严重程度。造模后,模型组A/左脑的比值和左脑/右脑的比值都明显升高,表明复合型血栓诱导剂造成了模型组大鼠脑血栓的形成,脑血管通透性增加,进而导致严重脑水肿。七十味高剂量组( 300 mg /kg) 、中剂量组( 150 mg /kg) 、低剂量组( 75 mg /kg) 的A/左脑、左脑/右脑比值与模型组相比都明显降低,表明七十味珍珠丸可以抑制血栓诱导剂造成的脑血栓形成,抑制脑血管通透性增加,减轻脑水肿。
血流速度在全身或局部减慢、在局部形成涡流均可促进血栓形成及凝血[7],表明血液流变学的病理改变( 血液粘度增高,血液浓缩,血流变慢等) 也是造成脑血栓形成至关重要的诱因之一。造模后,模型组全血粘度( 低切、中切、高切) 、血浆粘度、红细胞聚集指数都明显升高,表明复合型血栓诱导剂造成了大鼠血液流变学各指标的上调,产生了病理改变。而七十味珍珠丸各组与模型组相比都不同程度的降低了全血粘度( 低切) 、血浆粘度、红细胞聚集指数,表明七十味珍珠丸可以抑制复合型血栓诱导对大鼠血液流变学指标的上调,具有抗血栓形成的功效。
同时,血小板的黏附、聚集和释放功能与脑血栓形成有着密切关系。血栓素A2( TXA2) 和前列环素( PGI2) 是机体内调节血小板聚集的一对生物活性物质,二者的平衡是影响血小板功能的主要因素。TXA2是作用强烈的血管收缩因子,能使脑动脉痉挛,血管通透性增加,并能使血小板迅速聚集,促进脑血栓和脑水肿形成,因此,TXA2是测定血小板活化程度的敏感且特异性较高的指标之一[8]。而PGI2 是一种重要的抑制血管收缩物质,由内皮细胞释放,具有扩张血管、抑制血小板聚集、稳定细胞膜等作用[9]。血浆或组织中的TXA2-PGI2比例失衡是造成血小板聚集、血管痉挛收缩或血栓形成的原因之一。TXA2和PGI2的半衰期很短,但它们的代谢产物TXB2、6-keto-PGF1α 比较稳定,测定二者的含量可直接反映机体TXA2和PGI2的水平[10]。
本实验采用复合血栓诱导剂复制实验性脑血栓大鼠模型,造模后血浆中TXB2、6-keto-PGF1α 含量及TXB2 /6-keto-PGF1α 比例异常升高( P < 0. 01) ,表明在复合血栓诱导剂的作用下,血小板和血管内皮细胞均被激活,合成TXA2和PGI2增多,使TXA2 /PGI2失衡。而与模型组相比,七十味高剂量组( 300 mg /kg) 、中剂量组( 150 mg /kg) 、低剂量组( 75 mg /kg) 都不同程度降低了血浆中TXB2、6-keto-PGF1α 的含量,并降低了异常升高的TXB2 /6-keto-PGF1α 比例,表明七十味珍珠丸能抑制复合血栓诱导剂导致的TXA2和PGI2升高,可以调节TXA2和PGI2之间的动态平衡,从而抑制了血小板的聚集和血栓形成。
本次实验结果提示: 七十味珍珠丸对血栓诱导剂诱导的脑血栓形成具有抑制作用,可防止脑血栓形成后脑血管通透性增加,减轻脑水肿。七十味珍珠丸抗脑血栓作用机制可能与下调血液流变学各指标和调节TXA2、PGI2之间的动态平衡有关。