七十味珍珠丸对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用

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甄丽芳，罗远带，黄福开，胡贤达，邵杰，刘亚丽，尚颖，杜文兵

( 南方医科大学中医药学院，广州510515; 1 北京藏医院，北京100029)

　　摘要 目的:探讨七十味珍珠丸对永久性大脑中动脉阻塞( pMCAO) 大鼠的神经保护作用。方法: 取SD 大鼠用线栓法制备pMCAO 模型。观察七十味珍珠丸对pMCAO 大鼠神经功能损伤情况( Bederson 评分和Ｒotarod test) 、血清中神经元特异性烯醇化酶( NSE) 及S-100β 蛋白水平的影响。结果:与pMCAO 模型组比较，七十味高剂量组( 664mg /kg) 显着降低Bederson 评分，延长转棒潜伏期( P ＜ 0． 01) ;与pMCAO 模型组比较，七十味高剂量组( 664mg /kg) 、低剂量组( 166mg /kg) 中NSE 和S-100β 蛋白水平都有不同程度的下降( P ＜ 0． 01) 。结论:七十味珍珠丸可有效降低pMCAO 大鼠血清中NSE、S-100β 蛋白水平，改善其神经功能缺损，具有较好的神经保护作用，效应细胞既在神经元，又在神经胶质细胞。

　　关键词:七十味珍珠丸; 局灶性脑缺血损伤; 神经行为学; 神经元特异性烯醇化酶( NSE) ; S-100β 蛋白

　　缺血性脑卒中是一组以脑组织缺血性损伤和体征为主要临床表现的急性脑血管病，具有发病率高、致残率高和死亡率高的特点。神经细胞变性坏死是导致缺血性脑卒中患者死亡和严重病残的基本因素。因此，最大限度地保留健康的神经细胞是治疗缺血性脑卒中的重要环节。七十味珍珠丸( Ｒannasangpei)是藏医最有代表性的名贵珍宝藏成药之一，具有醒脑开窍、安神、镇静，通经活络，调和气血之功效，临床治疗缺血性脑卒中损伤( 中风、瘫痪、半身不遂、脑栓塞等) 效果良好。但是关于七十味珍珠丸神经保护作用的实验研究报道却甚少，现通过检测神经元特异性烯醇化酶( NSE) 和S-100β 蛋白的表达水平及神经功能损伤情况来观察七十味珍珠丸的神经保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验药物七十味珍珠丸由北京藏医院提供，批号:

　　20130109。维脑路通片( 曲克芦丁片) 由亚宝药业集团股份有限公司生产，批号: 20130701。

　　1.2 动物SPF 级SD 大鼠40 只，体重230 ～ 250g，雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号: SCXK 粤2013-0020( NO: 44005900000285) 。

　　1.3 试剂大鼠神经元特异性烯醇化酶( NSE) ELISA 试剂盒、S-100β 蛋白ELISA 试剂盒均购自广州拓科达生物科技有限公司。

　　1.4 仪器Thermo 酶标仪、2K-15 低温离心机、Panlab 转棒仪等均由南方医科大学生命科学楼解剖教研室提供。

　　1.5 方法大鼠40 只，随机分成5 组，即假手术组; pMCAO 模型组; 七十味低剂量组( 166mg /kg) ; 七十味高剂量组( 664mg /kg) ; 维脑路通组( 50mg /kg) ，每组各8 只大鼠。每天灌胃给药1次( 按体表面积法) ，连续14 天，于造模前1h 给药1 次，给药剂量及途径同前。假手术组和pMCAO 模型组用蒸馏水灌胃。造模前一个星期，每天上午9: 00 各组老鼠均进行转棒练习，每天1 次，每次5 分钟。

　　采用改良后的Zea Longa 模型［1］制作。实验动物以10% 的水合氯醛( 0． 32ml / 100g) 腹腔麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部正中切开皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露右侧颈总动脉( CCA) ，沿着颈总动脉快速分离劲外动脉( ECA) 和颈内动脉( ICA) 。电凝联系ECA 与ICA 之间的动脉。在右ECA 主干的远心端1． 5cm 处结扎，提拉ECA 残端的结扎线，用微型血管夹在CCA 分出ECA 处，将ECA 临时夹闭，在血管夹与ECA 残端之间结扎一道缝合线，不打紧。在ECA远心端死结与近心端活结之间开一小口，用制备好的直径为0．21mm 线栓沿ECA 插入，扎紧缝合线，绑住线栓，同时松开微型血管夹。当线栓头端进到ICA 与ECA 的分叉处。剪断开口上端的ECA，使线栓掉头进入右ICA，避开翼颚动脉( PPA) ，待线栓标记点( 距线栓顶端18mm 处做标记) 进到分叉内，有阻挡感时，扎紧线栓，缝合切口。在插线的过程中要注意手感，当遇到阻力时不要用蛮劲插入，当线栓弯曲时要更换，手法要轻柔、迅速。假手术组: 只是不插入线栓，其他步骤与上述步骤相同。

　　1. 5.1 神经功能缺损评分［2］ ( Bederson 评分) 各组大鼠于造模24h 后进行Bederson 评分。在规定时间点由三个协作者盲法评分，最后取平均值。模型建立成功的标准为评分≥l 分。

　　评分标准: 0 分: 提尾后( 距地1 米) ，大鼠两前爪完全伸向地面，无神经功能缺损; 1 分: 提尾后( 距地1 米) ，前肢出现任何屈曲成分，不伴其他不正常; 2 分: 拉住尾部，于大鼠肩后施加侧压，侧推抵抗力下降，伴前肢屈曲，无转圈行为; 3 分: 同2 级行为，伴自发性旋转( 自由活动时向瘫痪侧划圈) 。

　　1.5.2 神经运动功能测评［3］ ( Ｒotarod test) 各组大鼠造模24h 后上午9: 00，调整转棒速度为10rpm，将大鼠置于直径7 cm的旋转圆棒上，记录大鼠被置于棒上至跌落的时间( 潜伏期) ，每只动物重复测3 次，每次间隔60min，最后取平均值，转棒潜伏期≥3 分钟者，均记作3 分钟。测试结束标准为大鼠从转棒掉下或放弃行走而抓紧转棒旋转满2 周。测试前每只动物均进行两次适应性训练。

　　1.5.3 血清中神经元特异性烯醇化酶( NSE) 、S-100β 蛋白水平检测各组大鼠进行神经行为学测评后，分别腹主动脉采血4ml，4℃过夜待血液凝固后于3000rpm 离心10min，取血清分装，-20℃保存。按ELISA 试剂盒说明书测定血清中神经元特异性烯醇化酶( NSE) 、S-100β 蛋白水平。

　　2 结果

　　2.1 各组Bederson 评分比较与假手术组比较，pMCAO 模型组大鼠出现了明显的神经功能缺损，评分范围在2 ～ 3 分( P ＜0． 01) 。与pMCAO 模型组比较，七十味高剂量组( 664mg /kg) 和维脑路通组( 50mg /kg) 大鼠神经功能评分有不同程度的下降;七十味低剂量组( 166mg /kg) 与模型组神经功能评分无统计学差异。七十味高剂量组神经功能评分低于维脑路通组.

　　2.2 各组Ｒotarod test 测评比较与假手术组比较，pMCAO 模型组大鼠表现出较短的转棒时间。与pMCAO 模型组比较，七十味高剂量组( 664mg /kg) 、低剂量组( 166mg /kg) 和维脑路通组( 50mg /kg) 大鼠转棒潜伏期明显增加。七十味高剂量组大鼠表现出较长的转棒潜伏期，显着高于维脑路通组( P ＜ 0.01)

　　2.3 各组血清中神经元特异性烯醇化酶( NSE) 、S-100β 蛋白水平比较与假手术组比较，pMCAO 模型组大鼠NSE、S-100β蛋白水平均显着升高。与pMCAO 模型组比较，七十味高剂量组( 664mg /kg) 、低剂量组( 166mg /kg) 和维脑路通组( 50mg /kg)大鼠NSE 和S-100β 蛋白水平都有不同程度的下降。七十味高剂量组大鼠NSE、S-100β 蛋白水平显着低于维脑路通组。

　　3 讨论缺血性脑卒中通常是主要脑动脉或其分支的血栓形成或栓塞所致，最常发生的部位是大脑中动脉，目前在基础研究中脑缺血动物模型有许多种，其中线栓法造成大脑中动脉阻塞( middle cerebral artery occlusion，MCAO) 被公认为标准局灶性脑梗死动物模型［4］，其中永久性大脑中动脉阻塞模型( permanentmiddle cerebral artery occlusion，pMCAO) 因其不开颅，梗塞灶的大小、位置恒定，缺血效果稳定、可靠等优点被入选为本次研究的实验对象。由于鼠脑结构具有不对称性，左侧迷走神经直接分布于心脏，术中损伤对于心脏功能、血压等影响较大，为减少脑外因素的影响，本次实验选择右侧大脑中动脉永久性阻塞。

　　国际脑卒中治疗临床前研究指南( STAIＲ) 指出，在脑缺血药物研究中包括行为学在内多重指标综合评价，并强调行为学评价的重要性。在脑卒中实验研究中，神经功能损伤评分不仅是模型成功的标志，而且也反映了脑缺血的严重程度。Bederson评分因其操作简单，目前在国内应用比较广泛，但其较为主观，缺乏定量性，具有一定的局限性。本次实验又增加了定量神经运动功能检测( Ｒotarod test) ，客观定量的评价动物的运动协调功能。两种神经行为学( Bederson 评分和Ｒotarod test) 的结合能更准确的反映局灶性脑缺血造成的神经功能障碍程度。Bederson评分结果显示，与假手术组比较，pMCAO 模型组出现了明显的神经功能缺损，评分范围在2 ～ 3 分，说明pMCAO 大鼠模型制作成功; 七十味高剂量组( 664mg /kg) 与pMCAO 模型组相比可明显降低大鼠神经功能评分; Ｒotarod test 测评结果表明，七十味高剂量组( 664mg /kg) 表现出较长的转棒潜伏期，显着高于pMCAO 模型组和维脑路通组( 50mg /kg) 。本实验结果提示，七十味珍珠丸能够减轻大鼠pMCAO 后神经功能缺损程度，改善运动功能障碍，具有较好的神经保护作用。

　　神经元特异性烯醇化酶( Neuron-specific enolase，NSE) 是糖酵解途径的关键酶，属于糖酵解同工酶二聚体，特异性存在于神经元和神经内分泌细胞胞浆中，当神经元损伤或坏死后，NSE从细胞内溢出，进入脑脊液和血液中，因脑胶质细胞和其他脑神经组织不含NSE，故NSE 是是唯一反映神经元损伤的特异性生化指标。S-100β 蛋白是一种小分子酸性的钙离子结合蛋白，主要存在于中枢神经系统的星形细胞、少突神经胶质细胞以及周围神经系统的雪旺细胞，是神经胶质的标记蛋白。正常条件下不能通过血脑屏障( BBB) ，当颅脑损伤血脑屏障受到破坏时，S-100β 通过破损的血脑屏障进入血液中，血清中S-100β 的增高意味着神经损伤后胶质细胞的破坏和星形细胞反应状况，故S-100β 蛋白是反映脑损伤程度和预后的一个敏感指标［5］。与假手术组比较，pMCAO 模型组大鼠NSE、S-100β 蛋白水平均显着升高( P ＜ 0． 01) ，说明脑缺血导致神经元、神经胶质细胞的持续性死亡或继发性功能损伤引起了血清NSE 和S-100β 蛋白出现持续升高或继发性升高。与pMCAO 模型组比较，七十味高剂量组( 664mg /kg) 、低剂量组( 166mg /kg) 中NSE 和S-100β 蛋白水平都有不同程度的下降，说明七十味珍珠丸可降低大鼠pMCAO后血清NSE、S-100β 蛋白水平，减轻脑缺血后神经元、神经胶质细胞的继发性损伤。

　　上述实验结果提示，七十味珍珠丸可有效降低pMCAO 大鼠血清中NSE、S-100β 蛋白水平，从而减轻神经功能缺损程度，改善运动功能障碍，可见其具有较好的神经保护作用，效应细胞既在神经元，又在神经胶质细胞。

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