安肾胶囊根据难治性
肾病反复发作、病程长久、对激素依赖或使用激素治疗无效的特点创立,主要用于难治性肾病痰瘀互结证。本实验采用膜性肾病大鼠模型,运用安肾胶囊治疗,通过观察各指标的改变,研究本方药对肾病大鼠的治疗作用和机理。
目的:研究安肾胶囊对膜性肾病大鼠的治疗作用及机理。
方法:将50只SD雄性大鼠制成膜性肾病大鼠模型,然后按24 h尿蛋白定量结果随机分为模型组、雷公藤多苷组、安肾胶囊高、中、低剂量组(n=10),另外将10只未造模大鼠作为正常组。将各组大鼠分别灌胃4 w后,观察各组大鼠尿蛋白定量、血尿程度及肾脏组织病理学改变。
结果:与模型组比较,安肾胶囊高、中、低剂量组和雷公藤多苷组大鼠的24 h尿蛋白定量降低、血尿减轻、肾脏组织病变减轻。
结论:安肾胶囊对膜性肾病大鼠具有降低蛋白尿、控制血尿、修复肾小球病理损伤的作用,这可能是其治疗膜性肾病大鼠的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 SD雄性大鼠,体重(150±30)g,由国家药品监督管理局四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供。实验期间饲养于室温(20±3)℃环境,相对湿度:70%,12 h光、12 h暗的条件下,自由摄食全价大颗粒,饮水,驯养1 w后使用。
1.1.2 药品及试剂 安肾胶囊浸膏:由成都中医药大学附属医院药厂提供,棕褐色浸膏,每毫升含生药3 g。雷公藤多苷片:湖南省株洲市制药三厂生产,批号:066002,10 mg/片。阳离子化牛血清
白蛋白(C-BSA)、弗氏不完全佐剂:由四川大学华西医学中心提供。磺柳酸法试剂:成都中医药大学附属医院检验科自配。Buin's固定液、磷酸缓冲液(PBS)和2.5%戊二醛固定液:成都中医药大学附属医院药理研究室提供。
1.2 实验方法
1.2.1 造模 参照黄小平等[1]报告的大鼠原位性肾小球
肾炎模型制作方法:取雄性SD大鼠70只,放入大鼠代谢笼中(每笼1只),收取大鼠24 h尿液,作常规测定。选取小便正常大鼠作为受试动物,除随机抽取10只作正常组外,其余50只大鼠均制成膜性肾病模型:(1)预免疫:取1 mL浓度为2 mg/mL的C-BSA溶液与弗氏不完全佐剂混匀的乳白色悬液,分别一次性于每只大鼠的双侧腋下、腹股沟处作多点皮下注射,观察1 w。(2)免疫:预免疫结束1 w后,每只大鼠尾静脉注射1 mL浓度为2.5 mg/mL C-BSA,每周3次,共3 w。整个造模时间共4 w,造模完成后取所有实验动物24 h尿液作24 h尿蛋白定量测定,根据检测结果进行分组。
1.2.2 分组 将造模后的50只大鼠,按24 h尿蛋白定量结果随机分5组,分别为模型组、安肾胶囊高剂量组(高剂量组)、安肾胶囊中剂量组(中剂量组)、安肾胶囊低剂量组(低剂量组)、阳性药物对照组即雷公藤多苷组。另外将10只同批大鼠作为正常组。
1.2.3 给药 造模4 w分组后灌胃,具体如下:正常组、模型组:每天灌服等容量(1 mL/100 g)的蒸馏水。安肾胶囊高、中、低剂量组:每天灌服剂量分别为5 g/kg、2.5 g/kg、1.25 g/kg的安肾胶囊混悬液。雷公藤多苷组:每天灌服剂量为0.03 g/kg的雷公藤多苷片混悬液。每天灌胃1次,连续4 w,大鼠每周称重1次,根据体重调整给药剂量。
1.2.4 指标观察及检测方法
1.2.4.1 24 h尿蛋白定量观察:收集大鼠24 h尿液,用磺柳酸法测定尿蛋白含量,24 h尿蛋白定量=尿蛋白含量/L×24 h尿量。
1.2.4.2 血尿检测:收集每只大鼠24 h尿液,离心取上清液,采用H-100全自动尿液分析仪检测。
1.2.4.3 肾脏组织形态学变化:灌胃4 w后,将大鼠断头处死,立即分离肾脏,观察肾脏外观形态。随机间隔取材,取1个肾脏经肾门均匀纵切,随机间隔取样2块置于Bouins液中固定,逐级乙醇脱水,浸蜡,石蜡包埋,常规切片5 μm 2张,经“PAS+苏木精”染色,常规光镜观察,另1个肾脏经肾门最大面均匀切取1/6,置于2.5%戊二醛中固定,送检经透射电镜观察、照相。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.0统计软件处理,计量资料数据以平均值加减标准差(■±s)表示,采用单因素方差分析,组间比较采用q检验;等级资料采用Ridit分析。
2 结 果
2.1 各组大鼠的一般情况变化
正常组:大鼠饮食如常,反应灵敏,活动正常,体毛顺滑有光泽,二便正常。其余各组在受试期间见:致病免疫2 w后,动物大多表现为蜷缩少动,精神萎靡,体毛蓬松少光泽,饮食量少,部分大鼠尿液呈茶红色,有明显腹水及呼吸道感染,大便干、少;经给药治疗后,大鼠精神好转,进食稍有增加,反应灵活,小便转清,无明显肉眼酱红色尿,大便质软,量多。
2.2 治疗前后各组大鼠24 h尿蛋白定量变化情况
结果见表1。
从表1可以看出,除正常组大鼠外,其余各组大鼠经注射C-BSA 4 w造模后,24 h尿蛋白含量明显升高,与正常组比较均有显着性差异。经给药治疗4 w后,各药物治疗组24 h尿蛋白均显着降低,尤以安肾胶囊中量剂组和雷公藤多苷组降低明显,与模型组比较有非常显着性差异(P<0.01),安肾高剂量组和低剂量组次之;而安肾胶囊高剂量组与模型组比较,有显着性差异(P<0.05)。
2.3 治疗后各组大鼠血尿情况
结果见表2。
由表2可看出,治疗4 w后用药各组血尿程度均有所减轻,与模型组比较有显着性差异(P<0.05),而组间比较无明显差异。
2.4 肾脏组织形态学检查结果
2.4.1 肾小球病理形态光镜检查结果 正常组:肾小球呈圆形或卵圆形,可见肾小球毛细血管壁内皮细胞、上皮细胞、系膜细胞形态正常,基底膜完整、规则、均匀一致;肾小球囊腔清晰,未见异常。模型组:肾小球体积增大,囊腔变窄;毛细血管腔狭窄,毛细血管基底膜弥漫性增厚,可见毛细血管小叶边缘呈结节状(毛细血管丛分叶明显);细胞数增加,系膜基质增多;近曲小管水肿。高、中、低剂量组及雷公藤多苷组:肾小球体积略增大,但较模型组有所减轻,肾小球毛细血管基底膜增厚及变形有改善,肾小球囊腔大小接近正常,细胞数稍增加,基质略增多,毛细血管丛分叶现象轻微。结果见图1。
2.4.2 超微结构检测结果 正常组:肾小球滤过屏障三层结构完整、规则,肾小球毛细血管内皮细胞形态正常,分布均匀,上皮细胞足突排列整齐,无融合;基底膜规则,均匀一致,无增厚。模型组:肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚,内皮细胞增生,上皮细胞肿胀,足突广泛融合,系膜基质增生。部分肾小球滤过屏障三层结构紊乱。高剂量组:肾小球滤过屏障结构仍不规则,基底膜厚薄不均,上皮细胞肿胀,足突大量融合,较模型组病变改变不明显。中、低剂量组:肾小球轻微肿胀,基底膜增厚不明显,上皮细胞足突部分融合,与模型组比较病变有所减轻。雷公藤多苷组:肾小球上皮细胞足突不清晰,有部分融合,基底膜增厚。结果见图2。
3 讨 论
难治性肾病综合征之难治,一方面是由于脾肾亏损,而更主要的是由于湿、痰、瘀在整个疾病过程中互为因果,影响疾病发生发展致肺脾肾更加受病,水饮积聚,停滞成痰,凝痰聚瘀;凝血不散,水津混渗,血瘀痰滞,致痰瘀相互交结难解,故痰浊、瘀血互为因果,闭阻肾络是该病病机的特点。难治性肾病综合征在疾病过程中的一些宏观和微观表现(肾小球致基底膜增生、增厚、系膜细胞增生,足突融合,环丛节段硬变,管腔闭塞等一系列改变),均与中医痰瘀互结病理相似;现代中医工作者引进现代医学“病”的概念,重视肾病辨证规范化和客观化的研究,将辨病与辨证相结合,使证候辨析渐趋统一。有报道也肯定了这种微观的肾脏形态学改变可称为“肾内微型症积”,其病理基础即为痰瘀互结[2]。据此拟定安肾胶囊,治疗难治性肾病综合征,临床获相当疗效,本方由三棱、白芥子、莪术、瓦楞子等组成,诸药合用共奏消痰软坚散结之功,化痰祛瘀,双管齐下,使痰瘀分解;本实验亦证实此方能有效降低膜性肾病大鼠蛋白尿、减轻血尿、改善基底膜损伤程度,这正是其治疗难治性肾病的作用机理。可见,安肾胶囊组方不仅有中医理论指导,而且有现代医学研究佐证,有较强的科学性。
参考来源: 《山西中医学院学报》2008年3月8卷3期;《安肾胶囊对膜性肾病大鼠治疗作用的实验研究》;张焱