血尿为儿科各类肾脏病中最常见的症状,国内儿童发生率较高,近年研究提示,孤立性血尿并非良性过程,随着慢性肾脏病概念的提出,人们对其严重性更为关注,但目前尚无有效的治疗方法。
笔者在前期临床研究中发现,小儿血尿多表现为湿热证,予清热利湿之中药复方“金水清”能明显减轻血尿症状。为进一步探求中药治疗本病的作用机制,研制符合中医医理的
肾炎血尿模型尤为重要。现就两种血尿模型的比较结果报道如下。
目的:探讨价格低廉、中医证型突出的肾炎血尿模型的建立方法。
方法:将Wistar大鼠在口服并定时尾静脉注射牛血清
白蛋白的基础上,分别施以葡萄菌肠毒素B或高糖高脂等湿热因素造模,利用生物学方法、光学显微镜等手段对两种造模方法进行对比观察。
结果:两种造模方法均成功制成血尿明显、病理改变典型的系膜增殖性肾炎大鼠模型,加强湿热因素能加重水肿及尿血、尿素氮等水平。
结论:湿热模型组总体症状表现更符合临床中医湿热证型,是价格低廉且病理改变典型的肾炎血尿动物模型。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)6周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只,体质量(150±20)g,购自湖北省实验动物中心;高糖高脂饲料由湖北省中医院制剂科生产。(2)牛血清白蛋白(BSA),ROCHE购买;葡萄球菌肠毒素B(SEB),军事科学院微生物研究所提供。(3)SHH500GS人工气候箱(重庆市永生实验仪器厂);YCD205超声波加湿器(北京亚都科技股份有限公司)。
1.2 方法 40只大鼠经适应性饲养1周后,查尿红细胞、蛋白全部为阴性,随机分为4组,每组10只。
1.2.1 对照模型组参照胡海翔等[3]的方法。隔日灌胃含0.1% BSA的酸化水2 mL,第6周时定期尾静脉注射1% BSA缓冲液10 mg/(kg·d),连续3次,8周时尾静脉注射SEB 0.4 mg/(kg·d),连续3周。观察至第12周末。
1.2.2 湿热模型Ⅰ组 造模方法与对照模型组相似,但第4周时,参照吴仕九等[4]报道,增加饮食和环境因素。将大鼠置于恒温恒湿箱中(温度35 ℃,相对湿度95%),温度和湿度逐步提升,每日不超过5 ℃,120 h后移至自然环境。入箱前10 d和入箱期间,都以高糖高脂饲料喂养。第8周不用SEB,而是注射等量生理盐水。观察至第12周末。
1.2.3 湿热模型Ⅱ组 造模方法与湿热模型Ⅰ组相同,但在第5周,再次增加饮食和环境因素,置于造模箱中共240 h。
1.2.4 正常组 隔日口服酸化水2 mL,定期尾静脉注射生理盐水,至第12周末。
1.3 指标的观察及检测 定时观察、记录大鼠体温(肛温)、活动状态、食量、饮水、体质量、粪便、毛发等一般情况;用代谢笼每周末留尿检测各组大鼠12 h尿红细胞数,并于0,12周末留尿测24 h尿蛋白定量。
至12周末,禁食12 h后,麻醉处死,无菌摘除眼球取血,测血清总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮和肌酐;迅速打开腹腔取出肾组织,做光镜检测。
1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析,各组实验数据以±s表示,统计分析用单因素方差分析和t检验,检验差异有统计学意义设为P<0.05。
2 结果
2.1 一般情况 与正常组相比,造模动物均出现程度不等发热、嗜卧、行动呆滞、耸毛、饮水少、食欲不振、肛门红肿、大便烂、尿少色深、舌质暗红,部分大鼠出现眼眵、舌苔稍白腻、
腹泻、皮下水肿等表现。3~5 d后,各组上述表现基本恢复,但湿热模型Ⅱ组皮下水肿、尿少色深等情况持续到实验结束。且湿热模型大鼠体质量、入箱前24 h与出箱后24 h体温净增值较正常组、对照模型组显著增加,见表1;提示增加环境与饮食湿热因素后,能出现更明显的发热、水肿等表现。
2.2 尿素氮、血肌酐水平测定 12周末,与正常组比较,造模动物尿素氮、肌酐水平均有增高,对照模型组与湿热模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.3 尿红细胞及尿蛋白测定 与正常组相比,造模动物尿红细胞数、尿蛋白明显增多,且持续至实验结束。第9周,湿热模型Ⅱ组尿红细胞数开始显著多于湿热模型Ⅰ组,说明增加环境与饮食湿热因素能加重血尿;湿热模型组尿红细胞、蛋白定量在统计学上不及对照模型组。见表1,2。表1 各组实验大鼠入箱前24 h与出箱后24 h体温净增值12周末体质量、24 h尿蛋白、肾功能比较注:与正常组比较,aP<0.01;与对照模型组比较,bP<0.05,cP<0.01。 表2 各组实验大鼠尿红细胞比较注:与正常组比较,aP<0.01,与对照模型组比较,bP<0.05;cP<0.01;与湿热模型Ⅰ组比较,dP<0.05,eP<0.01。
2.4 血脂水平测定 12周末,与正常组比较,造模动物总胆固醇、三酰甘油水平明显增高,对照模型组与湿热模型组之间差异不明显;湿热模型Ⅱ组三酰甘油显著高于湿热模型Ⅰ组。(数据资料略)
2.5 光镜组织学检查 光镜下,造模大鼠均可见弥漫性肾小球系膜区增宽,系膜细胞、系膜基质增生,毛细血管腔狭窄,部分肾小球呈分叶状,个别肾小球萎缩,肾小囊轻度扩张,肾小管间质有炎细胞浸润。湿热模型Ⅰ组、湿热模型Ⅱ组病理改变相似,但没有对照模型组严重。
3 讨论
近年来,在中医药研究领域,以中医理论为基础建立相关动物模型已成为共识。要求从临床角度、从证入手复制“病证结合”的动物模型,使动物模型不仅符合西医各种疾病的病理特征,具备与临床疾病相似的病理演变过程和发展规律,而且有中医临床相关病证的特点,以保留中医精华,不失中医本色。笔者从众多资料中发现,胡海翔等研究的模型大鼠早期有嗜卧、耸毛、饮水少、食欲不振、大便烂等中医湿热表现,但呈一过性便自行恢复;造模中晚期,有持续血尿、蛋白尿,血清胆固醇、三酰甘油、血肌酐、尿素氮等指标升高,结合近年肾炎湿热证与上述指标密切相关的临床报道,可以认为,本模型近似中医肾炎湿热证,但不典型,且SEB价格昂贵(约占总造模成本的90%),多需从国外进口,不利于该模型的推广。中医认为:湿热的产生,不外外感与内生,以此为基础,笔者对胡海翔模型加以改良,不用SEB,而是通过饮食油腻、注入BSA损伤脾胃造成内湿,气候因素制造外湿,将产生湿热证的内因及外因有机的结合,其发病条件符合临床中医湿热证的产生机制,使模型更能反映中医肾炎湿热证的本质与全貌。
实验结果显示,两种造模方法都呈现出典型的病理特征和持续稳定的血尿、蛋白尿。湿热模型组的尿红细胞数、蛋白定量,虽然在统计学上不及对照模型组,但并不影响血尿模型的成功建立,且在临床特征上更能具备中医湿热证的特点,以湿热模型Ⅱ组最为明显。湿热模型组在体温、体质量、水肿表现上较对照模型组严重,持续时间更长,与中医湿热内蕴的临床表现相符;增加湿热因素后,湿热模型Ⅱ组在血尿、浮肿、体质量、三酰甘油等指标上均明显高于湿热模型Ⅰ组,尿蛋白、尿素氮、肌酐也有所加重,说明加强湿热因素能加重大鼠的病变程度。由于湿热既是本病的致病因素,也是病理产物,其滞留于肾,热伤肾络可加重血尿,湿浊下注而为蛋白尿,久则耗血伤阴,终致肾气匮乏,肾阳耗损,
肾虚无力主水、司开合,而见水肿、尿少等症。由此可推,如果对湿热模型组再增加湿热因素,是否能得出与对照模型组同样的,甚至更好的实验结果,此推论符合临床实际及中医医理,但需进一步实验的验证。
总之,认为不用SEB,仅增加湿热因素就能制成既有MsPGN病理特征,又符合中医湿热病机、证型的肾炎血尿模型,且价格低廉。至于湿热因素给予量的把握问题,尚需进一步探讨,使该模型更符合中医动物实验研究的需要。
参考来源:《中国中西医结合儿科学》2009年4月1卷2期;《两种肾炎湿热证血尿模型的比较》;刘晓鹰, 王文广, 杜恒