【摘要】 目的 检测沙眼衣原体(C.t)泌尿生殖道感染患者多形外膜蛋白(Pmp)的血清抗体,初步探讨Pmp蛋白与C.t 泌尿生殖道感染的相关性。方法 从临床选择20例正常人作为阴性对照组,77例C.t泌尿生殖道感染患者为阳性对照组,随访43例患者3个月,分为C.t持续感染组(19例)与转阴组(24例),采集患者和对照组的血清,Western印迹法检测Pmp蛋白血清抗体(Pmp-Ab),分组比较Pmp-Ab的阳性率,并同临床资料进行相关性分析。结果 Pmp-Ab阳性率在C.t感染组为90.20%(71/77),阴性对照组为20%(4/20),感染组明显高于阴性对照组(P<0.05)。在C.t感染组,9种Pmb-Ab都可检测到,但不同抗体的阳性率不同,PmpA~PmpI分别为61.04%(47例)、88.31%(68例),63.63%(49例)、28.57%(22例)、63.63%(49例)、75.32%(58例)、62.34%(47例)、77.92%(60例)和70.13%(54例);其中PmpB-Ab阳性率最高,PmpD-Ab阳性率最低。持续感染组与转阴组9种Pmp-Ab阳性率差异均无统计学意义。结论C.t泌尿生殖道感染患者可产生针对Pmp蛋白的抗体,不同的Pmp蛋白免疫原性有差别,Pmp蛋白抗体对机体的免疫保护作用不强,血清抗体存在个体差异。E型C.t的9种Pmp蛋白全部表达。
【关键词】 衣原体感染(糖原);衣原体,沙眼;细菌外膜蛋白质类;抗体生成
衣原体多形外膜蛋白(polymorphic membrane proteins,Pmp)是近年来新发现的位于衣原体外膜上的一个独特的蛋白质家族,推测它们可能具有黏附、分子转运、信号传导等细胞壁相关功能,并与衣原体的免疫逃逸和组织嗜性有关。美国马里兰大学衣原体研究中心Patrick教授组织美国、欧洲、亚洲几个研究中心共同进行Pmp蛋白抗体的临床检测,开展Pmp蛋白与沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,C.t)泌尿生殖道感染的相关性研究。现将我中心的实验结果回报如下。
资料与方法
一,病例来源
所有病例均来自2005年12月至2007年4月我院STD门诊。
1.感染组:人选标准,①本人或其配偶有非婚性关系;②男性有不同程度的尿道炎症状,女性有阴道异常分泌物,伴有或不伴有尿道刺激症状;③男性尿道、女性宫颈分泌物涂片在油镜视野下平均每视野中多形核白细胞数>4个;④分泌物检测C.t阳性(直接免疫荧光方法,采用FITC标记的沙眼衣原体EB抗体试剂盒,军事医学科学院微生物检验研究中心);⑤分泌物检测解脲支原体、淋球菌、真菌和滴虫阴性。共入选44例,女18例,男59例,平均年龄(33.79±9.25)岁,平均病程(10.65±15.45)个月。随访43例,分为持续感染组(予口服盐酸米诺环素100 mg每日2次,疗程14 d,治疗后3个月内两次检测C.t仍为阳性)19例,转阴组(上述治疗后临床症状消失,3个月内两次C.t检测均为阴性,检测时间各患者一致)24例。
2.阴性对照组:无泌尿生殖道感染症状,分泌物检测C.t解脲支原体、淋球菌、真菌和滴虫均阴性。共入选20例,女6例,男14例,平均年龄(3.15±5.11)岁。
二、方法
1.重组C.t多形外膜蛋白样品(rPmpA~I):由美国马里兰大学衣原体研究中心Patrick教授提供。
2.临床血清标本采集:抽取患者(抽血时间统一为有非婚性关系后3周)静脉血5 ml,室温静置2 h,待部分血清析出后,4000 r/min,离心10 min,取上部分血清分装100 µl/支,-80℃冰箱中冻存备用。
3.Western印迹法检测血清中的Pmp蛋白抗体:一抗为临床血清标本,二抗为山羊抗人IgG(美国Sigma公司)、BCIP/NBT底物显色试剂盒(北京Tiangen生物技术有限公司)。
4.数据统计:采用SPSS13.0软件进行卡方检验,显著性检验水准为α=0.05。
结果
一、rPmpA~I聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
rPmpA~I的相对分子质量分别为rPmpA-FL,107 800;rPmpB-N,135 000;rPmpC-N1,155 000;PmpD-FL,164 280;rPmpE-FL,112 090;rPmpF-FL,116 280;rPmpG-N1;,43 130;rPmpH-FL,110 720;rPmpI-N1,55 380,FL代表Pmp蛋白全长,N1代表Pmp蛋白具有免疫原性的N端片段(图1)。
二、Pmp蛋白血清抗体的临床检测结果
1.Pmp-Ab阳性率比较:感染组77例,其中71例Pmp-Ab阳性,6例阴性,Pmp-Ab阳性率92.20%;阴性对照组20例,4例Pmp-Ab阳性,16例阴性,Pmp-Ab阳性率20.00%,感染组Pmp-Ab阳性率明显高于阴性对照组,x2 =47.20,P<0.01。
2.感染组不同Pmp-Ab阳性率比较:77例患者血清中不同Pmp-Ab的检出率(表1),Pmp-Ab阳性率最高为88.31%,Pmp-Ab阳性率最低为28.57%。
3.持续感染组与转阴组Pmp蛋白抗体阳性率比较:两组9种Pmp蛋白抗体阳性率差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。
表1 沙眼衣原体泌尿生殖道感染患者不同Pmp蛋白抗体阳性率比较
x2 值和P值为持续感染组与转阴组阳性率比较结果
注:
讨论
pmp基因家族是衣原体基因组计划实施带来的新发现,编码相应的Pmp蛋白。C.t有9种pmp基因,编码蛋白PmpA~I;肺炎衣原体有21种pmp基因,鹦鹉热衣原体有17种。Pmp蛋白家族是衣原体独有的,尚未在其他病原体中发现。Pmp蛋白大小、序列都存在差异,表现为多形性。推测Pmp蛋白的相对分子质量在96 000 ~ 187 000之间。氨基端有保守的四肽基序GGA(I,L,V)和FXXN,羟基端有可切割的信号肽,表明Pmp蛋白位于衣原体外膜上。越来越多的研究表明,Pmp蛋白与衣原体的黏附、自动传递、信号转导、组织嗜性等有密切关系。
英国轮到UCL医院检测了65例C.t相关的盆腔炎性疾病(PID)患者的Pmp蛋白抗体,18例阳性,47例阴性,阳性率只有27.69%;美国Oakland研究中心检测了12例泌尿生殖道C.t感染者Pmp蛋白抗体,9例阳性,阳性率75%;两个中心只检测到了PmpB、C、D、G和I的血清抗体,为发现PmpA、E、F和H的血清抗体阳性。不同患者检测出Pmp-Ab种类不同,有个体差别。
我们将检测结果与患者的临床资料进行相关性分析,并同国外的检测结果进行对比,得出以下结论。
1.Pmp蛋白具有免疫原性,能够刺激机体产生抗体:国外两个中心以及我们实验室的临床检测都发现C.t泌尿生殖道感染者能够产生针对Pmp蛋白的血清抗体,证明Pmp蛋白具有免疫原性。
2.不同Pmp蛋白的免疫原性有差别:77例患者9种Pmp-Ab的阳性率有很大差别,其中PmpB-Ab阳性率最高,PmpD-Ab阳性率最低,说明不同的Pmp蛋白免疫原性可能存在差别。
3.Pmp蛋白血清抗体的免疫保护作用不强:我们的结果显示,持续感染者与转阴组9种Pmp蛋白抗体的阳性率差异均无统计学意义,说明Pmp蛋白血清抗体的免疫保护作用不强,这需要更大样本的检测加以证实。
4.Pmp蛋白的血清抗体存在个体差异:不同患者检出得抗体有明显差别,由得可检出全部9种抗体,有的则只有几种Pmp-Ab阳性,还有的患者抗体检测为阴性。
5. 9种Pmp-Ab均可在患者血清中检测到:尽管我们检测的77例患者血清Pmp-Ab阳性率不同,但9种Pmp-Ab均可再患者血清中检测到。此外,我们对部分C.t临床株进行了基因分型研究,其中1例患者生殖道标本分离出E型C.t,同时对其进行血清Pmp-Ab检测,发现9种Pmp-Ab全部阳性。这见解证明E型C.t的9种Pmp蛋白全部表达。